乳源酪蛋白糖巨肽對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群多樣性的影響

明 珠，陳慶森,*，劉雪姬，閆亞麗，趙林森，趙 培（.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 30034；.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899）

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乳源酪蛋白糖巨肽對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群多樣性的影響

明 珠1，陳慶森1,*，劉雪姬1，閆亞麗1，趙林森2，趙 培1
（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899）

摘 要：研究乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）對潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠腸道菌群多樣性的影響，從腸道菌群角度探討乳源CGMP改善潰瘍性結腸炎與腸道菌群變化關系的可能機制。惡唑酮（oxazolone，OXZ）誘導小鼠UC模型，設立正常對照組、模型對照組、乳源CGMP組（50 mg/（kg·d））和柳氮磺胺吡啶（salazosulfapyridine，SASP）治療組（40 mg/（kg·d）），其中正常對照組和模型對照組灌胃相應劑量的生理鹽水，連續灌胃7d。利用Ion Torrent PGM技術檢測實驗期間小鼠腸道菌群多樣性的變化。UC小鼠腸道菌群結構失調，其腸道菌群多樣性降低以及優勢菌群比例下降。對測序序列通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、UniFrac等統計分析發現，UC小鼠腸道中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度降低而放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的豐度升高。乳源CGMP干預后UC小鼠腸道菌群多樣性增加，厚壁菌門和擬桿菌門的相對比例高于模型組，提示乳源CGMP可通過調節失衡的腸道菌群來改善UC。

關鍵詞：乳源酪蛋白糖巨肽；惡唑酮；潰瘍性結腸炎；腸道菌群；Ion Torrent PGM技術

E-mail：ming_zhu999@126.com

引文格式：

明珠,陳慶森,劉雪姬,等.乳源酪蛋白糖巨肽對潰瘍性結腸炎小鼠腸道菌群多樣性的影響[J].食品科學,2016,37(5):154-161.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605028.http://www.spkx.net.cn

MING Zhu,CHEN Qingsen,LIU Xueji,et al.Effect of bovine casein glycomacropeptide(CGMP)on fecal microbiota community in mice with ulcerative colitis analyzed by Ion Torrent PGM platform[J].Food Science,2016,37(5):154-161.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605028.http://www.spkx.net.cn

乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）是Delfour等[1]于1965年發現的一種含有唾液酸的糖肽，它來自于酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白質——牛乳κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN）。在干酪制作中，牛乳κ-CN被凝乳酶酶解后生成不溶性的副κ-CN（肽鏈的1～105部分）和可溶性的親水多肽（肽鏈的106～169部分，稱為酪蛋白巨肽，caseinomacropeptide，CMP）兩部分。其中有30%～50%的CMP是以糖基化形式存在的，稱為酪蛋白糖巨肽[2]。乳源CGMP具有多種生物學功能，如抑制細菌和病毒的黏附[3]、促進益生菌的增殖[4]和調節免疫系統應答[5]等。許多研究已對乳源CGMP在動物腸道內促進益生菌增殖的作用進行了探索，天津市食品生物技術重點實驗室陳慶森團隊研究證實乳源CGMP可以促進正常小鼠腸道內有益菌的增殖，抑制有害菌的生長[6]，近期利用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH）結合DNA染色技術又證實了乳源CGMP作為益生菌增殖性底物的顯著功效。

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn’s disease，CD），是人類主要代謝性疾病之一。目前認為IBD的發病原因[7-8]為腸道微環境（腸道菌群）、宿主遺傳易感性[9]和黏膜免疫[10]因素三者間的相互作用。Sellon等[11]曾在IL-10－/－敲除的小鼠中發現在腸道無菌條件下小鼠保持健康狀態，但當在腸道內定植入典型的腸道共生菌時即引發結腸炎，說明腸道菌群與結腸炎的發生有關。Thompson等[12]隨后的研究表明，腸道菌群在IBD的發生發展中起著重要作用，IBD患者的炎癥部位和病變部位通常位于腸道內菌群濃度非常高的區域（如回腸和結腸）。在IBD的發病中，腸道菌群是作為一個整體而非某種單一細菌起作用，并提出IBD產生于宿主對共生菌群免疫應答的改變而非致病菌[13]。2010年華大基因分別對IBD患者和健康人群的腸道菌群進行測序，發現腸道菌群的基因有一部分基因與細菌在腸道內的功能有關，如對宿主細胞和蛋白質的附著作用等[14]。研究證明某些肽類物質可緩解UC的癥狀[15]，并在UC的治療上存在潛在的應用性[16]。López-Posadas[17]和Chen Qingsen[18]等發現CGMP可較好地保護結腸上皮細胞。同時研究發現Th1/Th2型細胞因子失衡是IBD發病的一個重要原因[19]，賈玉臣等[20]發現CGMP可以調節Th1/Th2的平衡，抑制腸道免疫病理損傷。還有研究表明乳源CGMP可通過抑制核轉錄因子（nuclear factor，NF）-κB途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑來改善小鼠的UC[21]。

本實驗在建立惡唑酮誘導小鼠UC模型的基礎上，灌胃乳源CGMP進行連續干預7 d，取糞便，利用Ion Torrent PGM技術檢測干預期間模型小鼠腸道菌群多樣性的變化，以確定乳源CGMP是否通過調整腸道內微生物菌群結構變化來預防和改善潰瘍性結腸炎作用。本研究將為生物活性短肽調控腸道微生物菌群改善腸道健康具有重要的理論價值和應用價值。

1　材料與方法

1.1實驗動物與試劑

BALB/c小鼠（SPF級），雄性，體質量（25±2） g、小鼠常規飼料購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號SYXK（津）2012-0004。

CGMP（純度71%） 新西蘭Tatua公司；柳氮磺胺吡啶（salazosulfapyridine，SASP） 上海三維制藥有限公司；惡唑酮（oxazolone，OXZ） 美國Sigma公司；瓊脂糖凝膠 法國Biowest公司；DNA聚合酶、Buffer、dNTP 日本TaKaRa公司；Aidlab純化試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；通用引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2儀器與設備

2.0Qubit?定量分析試劑盒、磁力架 美國Invitrogen公司；DYY-2電泳儀 北京六一儀器廠；N8050200 GeneAmp PCR System 美國ABI公司；508-U001 Ion Torrent測序平臺、INS1005527Ion One TouchTM2、8441-21 Ion One TouchTMES 美國Life Technologies公司。

1.3實驗分組與UC模型構建

BALB/c小鼠100 只，適應性喂養一周隨機分為4 組：正常對照組、模型對照組、乳源CGMP組（50 mg/（kg·d））以及SASP治療組（40 mg/（kg·d））。參考王姮等[22]的方法，略有改動。對小鼠腹部皮膚剃毛（2 cm×2 cm），涂搽3% OXZ 2 d進行致敏，致敏后的第2天晚上開始對小鼠禁食不禁水36 h，于第6天將硅膠管從肛門插入小鼠腸道約4 cm處，正常對照組灌注50%乙醇0.15 mL，模型對照組、CGMP組和SASP治療組均灌注1% OXZ （OXZ溶于50%乙醇）0.15 mL。

灌胃：造模后，對每組小鼠進行灌胃，具體灌胃劑量見表1。灌胃開始記為第1天，連續灌胃7 d。

表1　小鼠灌胃劑量Table 1 Gavage doses for mice in different groups

1.4腸道菌群結構的分子分析

1.4.1小鼠糞便細菌總DNA提取與擴增

1.4.1.1糞便細菌總DNA的提取

分別于灌胃前（0 d）以及實驗的第3、5、7、11天以及第21天用逼迫法分別采集4 組小鼠新鮮糞便約0.2 g，采用傳統酚-氯仿法提取小鼠糞便細菌基因組DNA。具體操作步驟參考文獻[23]。提取后的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并使用Qubit?定量分析試劑盒測定DNA濃度。

1.4.1.2糞便樣本16S rRNA V3和V6區基因的擴增

本研究中2 4 個樣本分別與V 3和V 6區帶有1 0 b p b a r c o d e標記的引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），并分別設有陰性對照，V 3區上游引物序列為5’-NNNNNNNNNNATTACCGCGGCTGCT-3’，下游引物序列為5’-NNNNNNNNNNCCTACGGGAGGCAGC AG-3’，其中下劃線部分為擴增細菌16S rRNA基因V3區的通用引物。V6區上游引物序列為5’-NNNNNNNN NNCGACAGCCATGCANCACC-3’，下游引物序列為5’-NNNNNNNNNNCNACGCGAAGAACCTTANC-3’，其中下劃線部分為擴增細菌16S rRNA基因V6區的通用引物。NNNNNNNNNN為區別不同樣本的10 個隨機組合的核苷酸堿基。V3區PCR反應體系（25 μL）包括：1.25 U Pyrobest DNA聚合酶，2.5 μL 10×buffer（含2.5 mmol/L MgCl2），2 μL 2.5 mmol/L dNTP，引物各0.75 μL和300 ng模板DNA。PCR反應在Life Pro基因擴增儀內進行，擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。V6區PCR反應體系（25 μL）包括：1.25 U Pyrobest DNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer（含2.5 mmol/L MgCl2），2 μL 2.5 mmol/L dNTP，引物各0.5 μL，模板DNA為3 μL。PCR反應在Life Pro基因擴增儀內進行，擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結果顯示，各樣本電泳條帶單一，說明所設計引物特異性較高，其中V6區PCR產物片段大小為108 bp，V3區為204 bp。V3區和V6區電泳凝膠使用Aidlab純化試劑盒純化并用Qubit測定濃度。每個樣品取200 ng進行等量混合純化進行后續的測序。測序在Ion Torrent平臺上進行。

1.4.2Ion Torrent測序

1.4.2.1Ion Torrent測序結果的質控

根據Ion Torrent操作流程進行測序，對所得的測序結果進行質控，符合以下標準的序列給予保留：1）至少有一端的引物能被匹配；2）序列中未知堿基數≤2；3）序列長度≥50 bp。

1.4.2.2生物信息分析

根據Barcode區分各樣本序列，通過在線的QIIME （quantitative insights into microbial ecology）對序列進行劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）和聚類分析。在種（97%相似度）的水平劃分OTU，在每個OTU中選擇冗余的序列作為OTU的代表序列，在Greengene上進行BLAST比對，鑒定其分類地位。利用OTU聚類產生的稀疏曲線（rarefaction curve）對取樣深度進行分析，最后使用UniFrac分析樣本間的進化關系。

1.5 統計分析

所有實驗數據利用SPSS 11.5統計軟件，進行單因素方差分析，處理結果均用表示。

2　結果與分析

2.1小鼠一般狀態及體質量的變化

根據實驗動物分組情況，觀察并測定實驗期間小鼠精神狀態及體質量的變化，結果見圖1。實驗期間觀察和測定的結果顯示，OXZ模型對照組的小鼠表現為進食量減少，活動程度降低，并伴隨有腹瀉，肛部黏連等現象；而正常對照組小鼠表現為大便及飲食正常，毛發有光澤，乳源CGMP組與SASP治療組的小鼠在實驗的前3 d有腹瀉反應。由圖1可知，模型對照組、乳源CGMP組和SASP治療組小鼠體質量在第3天與第0天相比下降，從第5天開始體質量上升，至實驗結束與正常對照組接近一致。在第3天時，模型對照組小鼠體質量的下降程度較大，與乳源CGMP組和SASP治療組產生顯著性差異（P＜0.05），乳源CGMP組和SASP治療組與正常對照組的小鼠體質量也存在一定差異性（P＜0.05）。

圖1　各組小鼠體質量變化Fig.1 Change in body weights of mice from various groups

2.2生物信息學分析

2.2.1測序質量評估

通過對細菌16S rRNA基因V3和V6可變區的PCR擴增及測序，共得到748 361 條有效序列，本研究基于種的水平，經過97%序列相似度歸并后V3區得到57 053 個OTUs，V6區得到64 312 個OTUs（圖2）。群落的豐度和多樣性以稀疏曲線、Shannon指數等形式進行說明。

圖2　測序結果讀長統計Fig.2 Statistics of sequencing reads

2.2.2小鼠腸道菌群的多樣性分析

根據每個樣本文庫中的OTU豐度信息，使用稀疏曲線（rarefaction curve）、Shannon指數來評估個體化基因組測序（personal genome machine，PGM）結果的多樣性，如圖3、4所示。圖3所示的稀釋曲線顯示序列較少時OTUs的數目顯著增加，隨著測序量的增大OTUs的數目增加緩慢，但仍未達到飽和，進一步提示小鼠腸道內仍有新的物種未被檢測到。圖4用來預測樣本微生物菌群的多樣性，雖然隨著測序量的增加不斷有新的物種出現，但Shannon指數曲線趨于平緩，基本達到飽和，說明本研究的測序量已基本能夠反映小鼠腸道菌群的多樣性。由Shannon多樣性指數可以看出，UC小鼠腸道菌群多樣性降低，其中以模型對照組表現最為明顯，乳源CGMP組小鼠腸道菌群的多樣性高于模型對照組和正常對照組，且乳源CGMP組第5天時的菌群多樣性為所有樣本中最高。說明灌胃一定劑量的乳源CGMP可以提高腸道菌群的多樣性，促進腸道微生態平衡，從而具有與SASP治療組相當的改善UC的效果。

圖3　稀疏曲線Fig.3 Rarefaction curve for human gut microbiome

圖4　Shannon多樣性指數Fig.4 Shannon’s diversity index

2.2.3乳源CGMP對UC小鼠腸道菌群豐度影響的分析

圖5從門的水平上對小鼠腸道內菌群的相對豐度變化進行了說明，V3區菌群豐度圖（圖5A）顯示各組小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成，總比例達到90%以上，其次為變形菌門和放線菌門。實驗第5天模型對照組小鼠腸道內擬桿菌門由70%下降至48%，而乳源CGMP組和SASP治療組小鼠中擬桿菌門的數量始終高于模型對照組，且乳源CGMP組與SASP治療組相比無顯著性差異，說明乳源CGMP可促進腸道內擬桿菌門細菌的生長。此外，從圖5A可以看出，柔膜菌門僅出現在乳源CGMP組，且比例較小。由圖5B可以看出，V6區厚壁菌門在各組小鼠腸道中占有相當大的比例，擬桿菌門在各組小鼠腸道內的比例明顯低于厚壁菌門，但模型對照組的厚壁菌門在乳源CGMP干預第3天數量最低。柔膜菌門在實驗各組均有出現，但是重復性不高。

圖5　各組小鼠腸道菌群門水平的豐度分析Fig.5 Relative abundance of mouse intestinal flora in the phylum level

小鼠腸道菌群經V3區門水平的相對豐度分析表明，各組小鼠腸道內的主要菌屬為擬桿菌屬、普雷沃菌屬（Prevotella）、Alistipes、梭菌屬和乳桿菌屬。實驗的第3天，除正常對照組外，其余3 組擬桿菌屬比例均有大幅度下降，到實驗的第5天時達到最低水平（比例＜5%），與正常對照組有極顯著性差異（P＜0.01）。灌胃結束時UC小鼠腸道內擬桿菌屬有所上升，至實驗結束時回到正常水平。普雷沃菌屬在實驗初始各組水平相差不大，第3天UC小鼠腸道內該菌比例顯著升高，在第5、7天時SASP治療組內該菌屬的比例超過總菌屬的一半以上。Alistipes在各組小鼠腸道內的比例不大，但在乳源CGMP干預第5天，在乳源CGMP組內數量顯著升高。此外，在第11天可看到乳源CGMP組內Blautia的水平高于其他3 組，且模型對照組在實驗結束時腸道內出現一定比例的Mucispirillum。對實驗各組在實驗期間菌屬種類和水平的變化進行比較發現，乳源CGMP組小鼠腸道菌屬種類多，研究提示對UC模型小鼠灌胃乳源CGMP可以增加腸道內菌群的多樣性。各組小鼠腸道內除未檢測到的菌屬外，主要包含Blautia、梭菌屬、糞球菌屬、普雷沃氏菌屬、螺桿菌屬和擬桿菌屬6 種。在實驗第3天開始對各組腸道菌屬比較發現，模型對照組不含Alistipes。乳源CGMP組腸道菌屬的多樣性高于其余各組，且Blautia在實驗第11天的乳源CGMP組合藥物組內比例較高，并出現有較小比例的鏈球菌屬，提示乳源CGMP有可能有益于Blautia和鏈球菌屬的增殖。

2.2.4UC模型小鼠腸道菌群結構的比較

從腸道菌群多樣性的比較發現模型組小鼠出現菌群多樣性減少的現象。應用主成分分析法（principal component analysis，PCA）研究各組小鼠菌群整體結構的差異性。如圖6、7所示，對所有樣本在97%序列相似性水平下劃分的OTU進行主成分分析，圖6表明實驗開始時各組小鼠腸道菌群之間具有差異性，模型對照組與其余3 組的差異主要在PC2方向上，PC2能夠解釋6.43%的差異性。在整個實驗過程中除模型對照組在第11天與其余各組菌群相似性不大，在實驗結束時發現SASP治療組的菌群結構與正常對照組的相似性極高，而乳源CGMP組與實驗開始時的正常對照組菌群相似性較為一致，說明乳源CGMP可以調節UC小鼠腸道菌群的平衡。由圖6C可以看出M7、M11、M21與S21和其余各組結構相似性均較低，在PC3方向上具有差異，PC3可解釋5.77%的差異性。即模型對照組腸道菌群結構與其余各組具有差異性，SASP治療在一定程度上也會改變腸道菌群的結構特征。

圖6　V3區主成分分析圖Fig.6 Comparison of gut microbiota composition among four groups based on 16S rRNA gene V3 region by principal components analysis(PCA)

如圖7B所示，M11、C11、S11、C7與實驗開始時4 組（D0、M0、C0和S0）的菌群結構有一定的相似性。但以上實驗樣本與其余樣本相比，在PC3方向具有差異性，且PC3可解釋5.11%。說明UC小鼠在實驗的第11天腸道菌群基本恢復到正常水平。在乳源CGMP干預第5天顯示乳源CGMP組和SASP治療組腸道菌群與正常對照組第21天的結構相似，其中乳源CGMP組的相似性稍高，進一步揭示乳源CGMP具有調節腸道菌群的能力，且作用效果優于藥物治療。圖7C顯示模型對照組在乳源CGMP干預結束時腸道菌群結構發生顯著變化，與其他3 組的菌群結構差異顯著。以上分析表明UC小鼠腸道內的確存在腸道菌群失調現象，對UC模型進行乳源CGMP和SASP干預后發現在較短短期內便可調節腸道菌群的平衡，且乳源CGMP的調節效果優于藥物治療，由此可得出適宜劑量的乳源CGMP可以通過調整腸道微生態平衡達到改善UC的病理狀況。

圖7　V6區主成分分析圖Fig.7 Comparison of gut microbiota composition among four groups based on 16S rRNA gene V6 region by principal components analysis(PCA)

2.2.5聚類分析

由PCA分析可知模型組在UC的恢復期與SASP治療組的菌群結構具有相似性，聚類分析結果（圖8）顯示在乳源CGMP干預的第3天正常對照組與其余3 組的腸道菌群結構有明顯的差異性，說明UC模型對照小鼠與正常對照小鼠相比，腸道菌群結構發生改變。乳源CGMP組和SASP治療組除第7天具有一定的差異性外，其余各取樣點的菌群結構均呈現一致性，進一步揭示在調節腸道菌群方面，乳源CGMP具有和腸道炎癥治療藥物相當的作用效果；從圖8B中也可以得出以上結論。

圖8　聚類分析圖Fig.8 Cluster diagram

2.2.6UC相關的特定細菌類群的鑒定

通過對測序序列信息進行分類分析，在97%相似度下對24 個樣本從門到屬進行各個水平的分類匯總。對V3和V6兩個可變區綜合分析發現，在門的水平上，Firmicutes和Bacteroidetes在UC模型的第3天總的比例出現下降。將這兩大菌門在屬水平上進行比較，UC模型Bacteroides屬的比例下降，與正常對照組相比差異極顯著（P＜0.01），Prevotella屬的比例則升高，說明Bacteroidetes門水平上的差異主要是由Bacteroides和Prevotella屬水平變化引起的。另一方面，Firmicutes中Clostridium在UC小鼠腸道內的比例增加，且Coprococcus在模型對照組中的比例較其他3 組始終處于較低水平，但差異不顯著。到乳源CGMP干預的第21天發現模型對照組出現有一定比例的Mucispirillum。在對實驗各組中的Lactobacillus的豐度進行比較發現，Lactobacillus在實驗的第11天乳源CGMP組比例急劇升高，與正常對照組和模型組有極顯著性差異（P＜0.01），與SASP治療組相比差異顯著（P＜0.05），而在其他取樣點發現無差異。

3　討 論

宿主內的腸道菌群受遺傳因素、生活環境、飲食習慣以及年齡等諸多因素的影響，宿主腸道菌群結構具有個體差異性。健康動物腸道菌群保持平衡，宿主與腸道菌群之間維持一種互惠共生的關系。但當受到宿主自身以及外界環境的干擾時，腸道菌群結構發生改變。越來越多的研究表明，肥胖、糖尿病以及炎癥性腸病等慢性代謝疾病均伴隨有腸道菌群失調現象[24]。Manichanh等[25]應用宏基因組文庫研究CD患者腸道菌群的多樣性，結果說明Firmicutes在CD患者腸道中的比例明顯減少，應用FISH技術對該菌門內的細菌進行定量分析后發現有益菌的數量顯著降低，揭示CD患者腸道菌群多樣性降低。本研究發現UC模型小鼠腸道內存在腸道菌群失調現象，主要為菌群組成的改變和多樣性的降低。表現在厚壁菌門 （Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）兩大菌門在腸道中比例的下降，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）豐度相對升高，通過對各組實驗樣品進行相似性比較及聚類分析發現，UC小鼠腸道菌群多樣性降低，其中以模型對照組表現最為明顯，乳源CGMP組在對UC模型進行干預后，其組內小鼠腸道菌群的多樣性高于模型對照組和正常對照組，說明灌胃一定劑量的乳源CGMP可以提高腸道菌群的多樣性。研究結果與Frank等[26]的研究結論有一定的相關性。通過屬水平的研究得到UC小鼠腸道內Bacteroides水平與正常對照組相比急劇降低，而Clostridium和Prevotella group出現升高趨勢，其中SASP治療組中Prevotella group在乳源CGMP干預的第5、7天比例顯著升高，含量超過所含總菌屬的一半以上。Bacteroidetes門中的Prevotella為機會致病菌，且有研究證明該菌屬細菌表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可促進人體成纖維細胞分泌IL-8 mRNA，進而加重炎癥反應[27]。Bacteroides是人結腸內優先產生丁酸鹽和短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的主要菌，本研究中結果發現Bacteroides水平降低，這與之前發現的IBD患者糞便樣本中SCFA的濃度降低相一致。此外，丁酸鹽為結腸上皮細胞的主要能量來源，可以通過組蛋白的高度乙酰化和抑制NF-κB信號通路來作為腸黏膜促炎細胞因子表達的抑制劑，丁酸鹽還可以促進黏蛋白和抗菌肽的產生來增強腸屏障功能，通過直接提高緊密結合蛋白的表達來增強腸上皮細胞的完整性[28]。因此，丁酸鹽水平的降低被認為與IBD的炎癥反應增強有關，并已被作為治療IBD的可能靶點[29]。Furet等[30]在研究肥胖患者經胃旁路術（roux-en-y gastric bypass，RYGB）治療后腸道菌群的變化時發現肥胖患者手術前體內Bacteroides/Prevotella group的比例明顯低于健康人群，且在手術治療后的3 個月比例有所升高。本研究中UC模型小鼠灌胃SASP前后，Bacteroides/Prevotella group的比例明顯下降。因此，推測藥物治療組雖能有效治療UC，但可能會導致肥胖癥的產生。Walker等[31]應用高通量克隆文庫技術和Q-PCR研究了IBD患者炎癥部位和非炎癥部位腸黏膜相關的菌群結構的變化，研究表明IBD患者腸道炎癥部位和非炎癥部位菌群結構存在很大差異性，Firmicutes在IBD患者腸道內比例降低，而Bacteroidetes和Enterobacteriaceae在CD病人中發現呈現升高趨勢。揭示IBD所出現的菌群失調現象可能是腸道環境的改變所引起，與疾病的發生無關。本研究認為乳源CGMP可以在較短時間內糾正UC模型小鼠腸道內的菌群狀態，且乳源CGMP的調節效果優于藥物治療，因此，本研究證實適宜劑量的乳源CGMP可以通過調整腸道微生態平衡達到改善UC的效果，對聚類分析結果亦得出相同的結論。

4　結 論

本研究采用個體化基因組測序（PGM）系統（Ion Torrent測序）探討了乳源CGMP對UC模型小鼠腸道菌群多樣性的影響，發現UC模型小鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度降低而放線菌門和變形菌門的豐度升高。研究結果還顯示乳源CGMP具有調節腸道菌群的能力，提示乳源CGMP干預UC小鼠后，其腸道菌群多樣性增加，在改善結腸炎癥方面，本研究結果發現且調控修復的效果優于SASP藥物治療。因此，CGMP可通過糾正腸道菌群失衡，維護腸道屏障功能來減輕炎癥反應，為乳源生物活性肽在營養性治療IBD方面提供一定的理論支持。

參考文獻：

[1]DELFOUR A,JOLLES J,ALAIS C,et al.Caseinoglycopeptides:characterization of a methionin residue and of the N-terminal sequence[J].Biochemical and Biophysical Research Communications ,1965,13(19):452-455.DOI:10.1016/0006-291X(65)90145-2.

[2]THOME W C,SORENSEN J,LOPEZ F R.Health effects and technological features of caseinomacropeptide[J ].International Dairy Journal,2006,16(11):1324-1333.DOI:10.1016/j.idairyj.2006.06.012.

[3]VACCA S A M,BOWEN W H.The effects of milk and κ-casein on salivary pellicle formed on hydroxyapatite discs in situ[J].Caries Research,2000,34(1):88-93.DOI:10.1159/000016558.

[4]BRUCK W M,KELLEHER S L,GIBSON G R,et al.rRNA probes used to quantify the effectsof glycomacropeptide and alphalactalbumin supplementation on the predominant groups of intestinal bacteria of infant rhesus monkeys challenged with enteropathogenic Escherichia coli[J].Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,2003,37:273-280.DOI:10 .1097/00005176-200309000-00014.

[5]OTAIN H,HATA I.Inhibition of proliferative responses of mouse spleen lymphocytes and rabbit Peyer’s patch ceils by bovine milk caseins and their digests[J].Journal of Dairy Research,1995,62(2):339-348.DOI:10.1017/S0022029900031034.

[6]曹晉宜,陳慶森,王友湘,等.酪蛋白糖巨肽(CGMP)對小鼠腸道菌群消長規律的影響[J].食品科學,2007,28(11):536-540.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2007.11.130.

[7]BIASI F,LEONARDUZZI G,OTEIZA P I,et al.Inflammatory bowel disease:mechanisms,redox considerations,and therapeutic targets[J].Antioxidants & Redox Signaling,2013,19(14):1711-1747.DOI:10.1089/ars.2012.4530.

[8]HUTTENHOWER C,KOSTIC A D,XAVIER R J.Inflammatory bowel disease as a model for translating the microbiome[J].Immunity,2014,40(6):843-845.DOI:10.1016/j.immuni.2014.05.013.

[9]KNIGHTS D,LASSEN K G,XAVIER R J.Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis:linking host genetics and the microbiome[J].Gut,2013,62(10):1505-1510.DOI:10.1136/gutjnl-2012-303954.

[10]ORD?S I,ECKMANN L,TALAMINI M,et al.Ulcerative colitis[J].The Lancet,2012,380:1606-1619.DOI:10.1016/S0140-6736(12)60150-0.

[11]SELLON R K,TONKONOGY S,SCHULTZ M,et al.Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice[J].Infection and Immunity,1998,66:5224-5231.

[12]THOMPSON C O C,MALDONADO J,GIL A.Aetiology of inflammatory bowel disease(IBD):role of intestinal microbiota and gutassociated lymphoid tissue immune response[J].Clinical Nutrition,2005,24:339-352.DOI:10.1016/j.clnu.2005.02.009.

[13]SHANAHAN F.Probiotics in inflammatory bowel disease-therapeutic rationale and role[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2004,56:809-818.DOI:10.1016/j.addr.2003.11.003.

[14]QIN J,LI R,RAES J,et al.The human gut microbial gene catalogue established by matagenomic sequencing[J].Nature,2010,464:59-65.DOI:10.1007/978-1-4614-6418-1_752-1.

[15]AZUMA K,OSAKI T,TSUKA T,et al.Effects of fish scale collagen peptide on an experimental ulcerative colitis mouse model[J].Pharmanutrition,2014,2:161-168.DOI:10.1016/j.phanu.2014.10.001.

[16]KIM S D,KWON S,LEE S K,et al.The immune-stimulating peptide WKYMVm has therapeutic effects against ulcerative colitis[J].Experimental & Molecular Medicine,2013,45(5):875-884.DOI:10.1038/emm.2013.77.

[17]L?PEZ-POSADAS R,REQUENA P,GONZ?LEZ R,et al.Bovine glycomacropeptide has intestinal antiinflammatory effects in rats with dextran sulfate-induced colitis[J].Journal of Nutrition,2010,140(11):2014-2019.DOI:10.3945/jn.109.118448.

[18]CHEN Q,WANG H,ZHU C,et al.Anti-apoptotic effects of milkderived casein glycomacropeptide on mice with ulcerative colitis[J].Food & Agricultural Immunology,2014,25(4):453-466.DOI:10.108 0/09540105.2013.823912.

[19]RADFORD-SMITH G,JEWELL D P.Cytokines and inflammatory bowel disease[J].Bailliere’s Clinical Gastroenterology,1996,10(1):151-164.DOI:10.1016/S0950-3528(96)90045-7.

[20]賈玉臣,陳慶森.乳源糖巨肽對小鼠IFN-γ和IL-4的調節作用[J].中國乳品工業,2010,38(11):11-14.DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2010.11.003.

[21]MING Z,JIA Y C,CHEN Q,et al.Amelioration effect of bovine casein glycomacropeptide on ulcerative colitis in mice[J].Food & Agricultural Immunology,2015,26(5):717-728.DOI:10.1080/09540105.2015.1018874.

[22]王姮,歐陽欽,羅文杰.惡唑酮結腸炎小鼠模型的建立[J].胃腸病學,2004,9(2):77-80.DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2004.02.004.

[23]金晶,彭穎,李曉波.快速提取腸道微生物基因組DNA的方法[J].現代生物醫學進展,2007,7(1):100-103.DOI:10.3969/j.issn.1673-6273.2007.01.034.

[24]賈玉臣,陳慶森.乳源酪蛋白糖巨肽改善小鼠潰瘍性結腸炎的研究[J].食品科學,2010,31(21):365-368.DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2010.11.003.

[25]MANICHANH C,RIGOTTIER G L,BONNAUD E,et al.Reduced diversity of fecal microbiota in Crohn’s disease revealed by a metagenomic approach[J].Gut,2006,55(2):205-211.DOI:10.1136/gut.2005.073817.

[26]FRANK D N,AMAND A L S,FELDMAN R A,et al.Molecularphylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2007,104(34):13780-13785.DOI:10.1073/pnas.0706625104.

[27]TAMURA M,TOKUDA M,NAGAOKA S,et al.Lipopolysaccharides of Bacteroides intermedius(Prevotella intermedia)and Bacteroides(Porphyromonas)gingivalis induce interleukin-8 gene expression in human gingival fibroblast cultures[J].Infection andImmunity,1992,60(11):4932-4937.

[28]VANHOUTVIN S A,TROOST F J,HAMER H M,et al.Butyrateinduced transcriptional changes in human colonic mucosa[J].PLoS ONE,2009,4(8):e6759.DOI:10.1371/journal.pone.0006759.

[29]GALVEZ J,RODR?GUEZ C M E,ZARZUELO A.Effects of dietary fiber on inflammatory bowel disease[J].Molecular Nutrition & Food Research,2005,49(6):601-608.DOI:10.1002/mnfr.200500013.

[30]FURET J P,KONG L C,TAP J,et al.Differential adaptation of human gut microbiota to bariatric surgery-induced weight loss:links with metabolic and low-grade inflammation markers[J].Diabetes,2010,59(12):3049-3057.DOI:10.2337/db10-0253.

[31]WALKER A W,SANDERSON J D,CHURCHER C,et al.Highthroughput clone library analysis of the mucosa-associated microbiota reveals dysbiosis and differences between inflamed and non-inflamed regions of the intestine in inflammatory bowel disease[J].BMC Microbiology,2011,11(2):7.DOI:10.1186/1471-2180-11-7.

E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn

Effect of Bovine Casein Glycomacropeptide(CGMP)on Fecal Microbiota Community in Mice with Ulcerative Colitis Analyzed by Ion Torrent PGM Platform

MING Zhu1,CHEN Qingsen1,*,LIU Xueji1,YAN Yali1,ZHAO Linsen2,ZHAO Pei1
(1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China; 2.Hebei Inatural Biological Technical Company,Shijiazhuang 050899,China)

Abstract:In order to investigate the modulation of casein glycomacropeptide(CGMP)on the diversity of intestinal flora in mice with ulcerative colitis(UC),an oxazolone-induced mouse model with ulcerative colitis was used to explore the intestinal flora in the presence of CGMP and the mechanism underlying the treatment of ulcerative colitis through CGMP.The mice with oxazolone-inducedulcerative colitis were divided into four groups including normal control group,model control group,CGMP group and salazosulfapyridine(SASP)group.After oxazolone challenge,the mouse in model control group were given regular feed as same as that provided to normal control group,and the mice in CGMP group and SASP group were administrated with CGMP at 50 mg/(kg·d)and SASP at 40 mg/(kg·d)for 7 consecutive days.Ion Torrent sequencing technology was applied to detect the diversity of intestinal flora in mice.Marked structural changes were discovered in the gut microbiotaof mice with ulcerative colitis,showing a reduction in intestinal flora diversity and decline in dominant bacterial populations.The sequencing data were analyzed by multivariate statistical methods and the results s howed that the abundance of Bacteroidetes and Firmicutes were significantly decreased,whereas Actinobacteria and Proteobacteria were increased.The intestinal bacterial diversity in UC mice was increased after the intervention of CGMP,indicating that CGMP could improve the oxazolone-induced ulcerative colitis of mice by adjusting the imbalanced intestinal flora.

Key words:casein glycomacropeptide(CGMP); oxazolone; ulcerative colitis; intestinal microbiota; Ion Torrent PGM platform

中圖分類號：book=155,ebook=162TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0154-08

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605028

*通信作者：陳慶森（1957—），男，教授，碩士，研究方向為發酵生物技術、功能成分與腸道健康的關系。

作者簡介：明珠（1992—），女，碩士研究生，研究方向為發酵生物技術、功能成分與腸道健康的關系。

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31071522）

收稿日期：2015-07-22