二十碳五烯酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響及機制

王炎炎，宋志秀,2，楊立剛，夏 惠，孫桂菊,*（.東南大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 20009；2.南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇 南京 20046）

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二十碳五烯酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響及機制

王炎炎1，宋志秀1,2，楊立剛1，夏 惠1，孫桂菊1,*
（1.東南大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.南京中醫藥大學第二臨床醫學院，江蘇 南京 210046）

摘 要：目的：研究二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響。方法：將THP-1單核細胞、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）和氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）共同培養建立泡沫細胞模型，以不同濃度（200、100、50 μmol/L）的EPA處理細胞48 h后，采用酶法測定細胞內總膽固醇（total cholesterol，TC）及膽固醇酯（cholesterol ester，CE）含量，采用酶聯免疫吸附實驗（euzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定細胞上清液中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量，采用半定量反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）測定三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）mRNA表達水平。結果：與模型組比較，EPA干預組細胞內TC及CE含量均降低，并存在顯著差異（P＜0.05）；細胞上清液中IL-6及TNF-α含量也顯著降低（P＜0.05），并具有量-效關系；低濃度的EPA具有上調ABCA1 mRNA表達的作用。結論：EPA能夠降低泡沫細胞內TC的蓄積，抑制泡沫細胞的形成，降低IL-6及TNF-α炎性因子的分泌水平，能夠上調ABCA1 mRNA表達水平，進而預防動脈粥樣硬化的發生發展。

關鍵詞：二十碳五烯酸；泡沫細胞；動脈粥樣硬化

江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目（SJZZ_0031）；中國營養學會營養科研基金-帝斯曼專項科研基金項目（201326）

Effect of Eicosapetaenoic Acid on THP-1 Macrophage-Derived Foam Cell Formation and Its Mechanism of Action

WANG Yanyan1,SONG Zhixiu1,2,YANG Ligang1,XIA Hui1,SUN Guiju1,*
(1.Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering,Ministry of Education,Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Southeast University,Nanjing 210009,China; 2.Second Clinical Medical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China)

Abstract:Objective:To investigate the effect of eicosapetaenoic acid(EPA)on the formation of THP-1 monocyte-derived foam cells.Methods:THP-1 monocytes were cultured with phorbol myristate acetate(PMA)and oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL),and intervened by EPA at concentrations of 200,100 and 50 μmol/L for 48 hours.The cholesterol content of foam cells was measured by cholesterol kit.The concentrations of IL-6 and TNF-α in culture supernatant were detected by ELISA.The expression of ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1)was detected by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Results:EPA decreased the intracellular concentration of cholesterol(P < 0.05)when compared with the control group.EPA decreased the concentrations of IL-6 and TNF-α in culture supernatant(P < 0.05)in a dose-dependent manner and low-dose EPA increased the expression of ABCA1 mRNA.Conclusion:EPA reduces the accumulation of intracellular cholesterol and inhibits the transformation of macrophages into foam cells.EPA decreases the secretion of inflammatory factor and low-dose of EPA increases the expression of ABCA1 mRNA,which may partially explain its anti-atherosclerotic activity. Phycobiliprotein is a light-harvesting pigment in red and blue-green algae.It is widely used in the pharmaceutical industry due to its antioxidant activity and anticancer activity.In Nostoc sphaeroides Kützing,phycocyanin and phycoerythrin are major varieties of phycobiliprotein.However,the effect of Nostoc sphaeroides Küting phycobiliprotein(NSKP)on immune functions remains unclear.In the present study,the immunoenhancing effect of NSKP in Kunming mice was explored.The mice were administered with NSKP at dosages of 100,300 and 500 mg/(kg·d)(body mass)by gavage once a day.After administration for 30 consecutive days,the immune parameters including the phagocytosis of peritoneal macrophages,natural killer cell activity,the proliferation of T lymphocytes,cytokines levels,antibody production,hemolytic complement activity and delayed-type hypersensitivity were measured.The results showed that NSKP promoted the phagocytosis of peritoneal macrophages,the function of natural killer cells,and the proliferation of T lymphocytes,as well as increased the levels of interleukin(IL)-2 and IL-4 and serum hemolysin.Meanwhile,the response of delayed-type hypersensitivity in NSKP group was also dramatically higher than that in the control group.Therefore,NSKP is a potential immunoenhancing agent.

Key words:eicosapetaenoic acid; foam cell; atherosclerosis Nostoc sphaeroides Küting; phycobiliprotein; immune function; cytokine

引文格式：

王炎炎,宋志秀,楊立剛,等.二十碳五烯酸對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響及機制[J].食品科學,2016,37(5):162-166.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605029.http://www.spkx.net.cn

WANG Yanyan,SONG Zhixiu,YANG Ligang,et al.Effect of eicosapetaenoic acid on THP-1 macrophage-derived foam cell formation and its mechanism of action[J].Food Science,2016,37(5):162-166.(in Chinese with English abstract)

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是發展中國家居民的主要死因之一[1]，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是CVD的主要病因，AS形成和發展的核心步驟是巨噬細胞源性泡沫細胞的形成[2]。巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）導致細胞內大量膽固醇酯（cholesterol ester，CE）積聚是泡沫細胞形成的主要機制[3]。近年來，大量研究表明二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）具有抗單核細胞募集、抗炎、抗血栓、調節血脂水平等抗動脈粥樣硬化作用[4-6]。但EPA抑制AS發生和發展的分子機制尚不明確，需要進一步研究。本實驗通過檢測不同濃度EPA對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內總膽固醇（total cholesterol，TC）和CE含量、炎性因子表達水平及三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）mRNA表達水平的影響，研究EPA對THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響，探討其預防AS的相關機制。

1　材料與方法

1.1細胞與試劑

THP-1人單核細胞 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

胎牛血清 美國Gibco公司；無脂肪酸牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Equitech-Bio公司；ox-LDL 廣州奕源生物科技有限公司；EPA、佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、油紅O、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒 美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）相關引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫吸附實驗（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒 煙臺賽爾斯公司；總蛋白質測定試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、RPMI-1640培養基 南京凱基生物制藥有限公司；TC測定試劑盒、游離膽固醇（free cholesterol，FC）測定試劑盒 北京普利萊公司。

1.2泡沫細胞模型的建立

取處于對數生長期的THP-1人單核細胞，加入適量PMA貯備液使PMA終濃度為160 nmol/L，靜置培養48 h。取經PMA誘導分化后的巨噬細胞，經80 mg/L的ox-LDL刺激48 h即可形成泡沫細胞。采用油紅O染色法觀察泡沫細胞內脂滴分布情況，判斷泡沫細胞模型是否建立。

1.3分組及處理

EPA充分溶解于無水乙醇，獲得母液，臨用前再用含0.5%無脂肪酸BSA的無血清RPMI-1640培養液稀釋至適當濃度。THP-1人單核細胞分化成巨噬細胞，分別注于96 孔板培養后棄殘余液體，分別加入含有50、100、200、400、600 μmol/L EPA的新鮮培養基，每個濃度設5 個復孔，培養48 h后去除培養液，加入5 mg/mL MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h后終止培養，棄上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，振蕩1 min，用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度，以無細胞孔作為空白組，無EPA處理作為對照組。按照下式計算泡沫細胞存活率，確定EPA對細胞的無毒性劑量。

根據MTT結果設定EPA高、中、低3 個干預劑量（200、100、50 μmol/L），即實驗細胞共分為4 組，分別為模型組和3 個不同劑量的EPA干預組。

1.4指標檢測方法

1.4.1TC、FC和CE水平的測定

采用酶法測定泡沫細胞內TC、FC和CE水平：裂解泡沫細胞，分別取500 μL細胞裂解液用E1015和E1016兩種試劑盒進行TC、FC和CE水平測定，按照說明書方法進行操作，用酶標儀在550 nm波長處讀各管光密度（OD550 nm）值，同樣測定標準品、空白對照組（乙醇）的OD550 nm，繪制標準曲線并計算待測樣品中的膽固醇含量。以試劑盒所測定出的是TC和FC含量，兩者差值即為CE含量，膽固醇含 量的單位以nmol/mg pro表示。

1.4.2細胞內蛋白質含量的測定

采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定法測定泡沫細胞內蛋白質含量：取1.4.1節剩余的細胞裂解液，用BCA蛋白質測定試劑盒進行蛋白質含量測定，按照說明書方法進行操作，在562 nm波長處比色測定讀取樣品及標準品OD562 nm，繪制出標準曲線，計算各樣品蛋白質含量。

1.4.3炎性因子水平的測定

收集細胞培養上清液，采用IL-6 ELISA試劑盒及TNF-α ELISA試劑盒測定細胞上清液中IL-6和TNF-α的水平，按照說明書方法進行操作，用酶標儀以空白孔調0，在450 nm波長處讀取OD450 nm，根據標準品的炎性因子水平以及對應的OD450 nm分別繪制出標準曲線，根據樣品的OD450 nm計算出樣品中的IL-6和TNF-α水平。

1.4.4ABCA1 mRNA表達水平測定

收集各處理組細胞，用Trizol法提取總RNA，保存于－70 ℃備用。利用常規半定量RT-PCR技術，以GAPDH基因作為內參，測定ABCA1基因轉錄表達水平。其中PCR引物序列為：ABCA1上游：5’-ATCAAGGGCATCGTGTATGAG-3’，下游：5’-AGGATTGTCACCACAGCAAAC-3’；GAPDH上游：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，下游：5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’。PCR循環參數：94 ℃、5 min（預變性）；94 ℃、30 s，56 ℃、45 s，72 ℃、30 s，30 個循環，72 ℃延伸5 min。PCR產物用2%瓊脂凝膠電泳檢測，用Quantity ONE軟件對電泳結果進行灰度掃描，通過灰度值統計分析結果間接推測各處理組相關基因的相對表達水平。

1.5統計學處理

2　結果與分析

2.1THP-1細胞泡沫化結果

倒置顯微鏡下觀察，明顯可見THP-1人單核細胞在PMA的誘導下由規則的圓形懸浮細胞變為形態不規則梭形貼壁細胞，并可見大量細胞伸出偽足（圖1a）。隨后用80 mg/L的ox-LDL孵育48 h，經油紅O染色，在顯微鏡下觀察可見細胞漿內大量 脂滴存在，符合泡沫細胞的特點（圖1b），即泡沫細胞模型建立成功。

圖1　THP-1巨噬細胞及THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞形態Fig.1 THP-1 monocyte-derived macrophages and macrophage-derived foam cells stained by Oil Red O

2.2EPA干預對泡沫細胞存活率的影響

采用MTT法進行泡沫細胞存活率的測定，如圖2所示，EPA干預48 h后，與模型組（EPA濃度為0 μmol/L）相比，200、100、50 μmol/L這3 個劑量組泡沫細胞存活率無顯著差異（P＞0.05），這3 個劑量的EPA均不具有細胞毒性。400、600 μmol/L EPA干預組的泡沫細胞存活率急劇下降，且與模型組相比存在顯著差異（P＜0.05）。因此，后續實驗選取200、100、50 μmol/L 這3 個劑量的EPA，以保證細胞處于較好的狀態。

圖2　不同濃度EPA干預下泡沫細胞生存率（x ±s，n＝55）Fig.2 Cell viability after EPA treatment(x ± s,n = 5)

2.3不同濃度EPA對泡沫細胞內膽固醇含量的影響#

圖3　不同濃度EPA對泡沫細胞內膽固醇含量的影響（x ±s，n＝33）Fig.3 Effect of EPA on intracellular cholesterol level in foam cells(x ± s,n = 3)

由圖3可知，與模型組相比，各EPA干預組細胞內TC、FC水平均極顯著降低（P＜0.01），50、100 μmol/L組細胞內CE水平與模型組相比極顯著降低（P＜0.01），200 μmol/L組細胞內CE水平雖然有所降低，但與模型組間無顯著差異（P＞0.05）。細胞內的TC、FC、CE水平在50、100、200 μmol/L這3 個劑量組之間并不存在量-效關系，200 μmol/L EPA對細胞內膽固醇水平的降低作用低于100 μmol/L EPA。這可能是由于EPA屬于產能營養素，在產生生物活性的同時也會進行β-氧化供能，當EPA濃度過高時，過量的EPA會進入非氧化代謝途徑，此時會產生大量活性氧和活性氮類物質，使細胞功能受損[7-8]。200 μmol/L組對細胞內膽固醇水平的降低作用不如100 μmol/L組明顯，可能是因為高劑量EPA作用下，細胞的部分功能受損。Song Yue等[9]用200 μmol/L 的EPA干預THP-1巨噬細胞源泡沫細胞72 h后，細胞存活率顯著降低。另一個可能的原因是EPA不飽和程度高，濃度過高會加劇脂質過氧化的發生，使得EPA不僅功效喪失，還會產生有害作用。張奕等[10]用200 μmol/L EPA干預細胞48 h后發現培養液中丙二醛的濃度顯著增加。由此推測，本實驗中雖然200 μmol/L EPA干預48 h對細胞存活率沒有影響，但是細胞功能可能同樣受到了損害。因此，3 個EPA干預劑量沒有呈現良好的量-效關系，以100 μmol/L EPA的干預效果最好。

2.4不同濃度EPA對泡沫細胞ABCA1 mRNA表達水平的影響

圖4　不同濃度EPA對泡沫細胞AABBCCAA11 mRNA表達水平影響Fig.4 Effect of EPA on ABCA1 mRNA expression in foam cells

如圖4所示，經EPA處理后，50、100 μmol/L組泡沫細胞的ABCA1 mRNA相對表達量顯著高于模型組（P＜0.05），100 μmol/L組泡沫細胞的ABCA1 mRNA相對表達量高于50 μmol/L組。200 μmol/L組泡沫細胞的ABCA1 mRNA相對表達量反而降低的原因與2.3節所闡述的EPA對細胞內膽固醇的反作用原理相同，可能是因為高劑量的EPA造成了細胞部分功能的損害。

2.5不同濃度EPA對泡沫細胞上清液中炎性因子分泌水平的影響

圖5　不同濃度EPA對泡沫細胞上清液中炎性因子分泌量的影響（x±s，n＝33）Fig.5 Effect of EPA on the secretion of inflammatory factors in　foam cell supernatant(x± s,n = 3)

如圖5a所示，與模型組相比，200 μmol/L組泡沫細胞上清液中的IL-6含量與極顯著降低（P＜0.01），50、100 μmol/L組泡沫細胞上清液中的IL-6水平有所降低，但與模型組間無顯著差異（P＞0.05），EPA各劑量組之間存在量-效關系。如圖5b所示，與模型組相比，EPA各劑量組泡沫細胞上清液中的TNF-α水平極顯著降低（P＜0.01），EPA各劑量組間也存在顯著差異，且同樣具有量-效關系。

3　討 論

EPA屬于n-3系列多不飽和脂肪酸，海產品、深海魚油是EPA重要的膳食來源，寒冷地區深海中肥魚EPA含量高，如鯖魚、鮭魚、金槍魚等[11-12]。近年來，大量研究表明EPA具有抗AS作用[4-6]。AS的發生、發展是多因素長期綜合作用的過程，泡沫細胞形成是AS發生的早期事件和關鍵環節，在AS早期，巨噬細胞內無限制地聚集大量膽固醇脂滴，形成巨噬細胞源性泡沫細胞[13]；AS中后期，泡沫細胞內過量蓄積的脂質最終導致其凋亡或壞死，細胞胞漿內脂質釋放形成脂質堆積，導致血管壁形成纖維化斑塊[14]。因此，泡沫細胞形成和發展貫穿AS發生發展始終，并起到至關重要的作用。而巨噬細胞內膽固醇穩態失衡是泡沫細胞形成的重要原因[15]，巨噬細胞膽固醇穩態失衡使其膽固醇攝入量增加、膽固醇酯合成增加以及膽固醇流出減少，導致細胞內膽固醇蓄積泡沫細胞形成[16]。本實驗發現，100、50 μmol/L的EPA能極顯著降低THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞內TC、FC、C E水平，可見EPA能降低泡沫細胞內膽固醇蓄積，這與Salehipour等[17]的研究結果一致。而200 μmol/L的EPA干預卻不如100 μmol/L的EPA，這提示過高的劑量的EPA反而不利于抑制泡沫細胞的形成。

人ABCA1是染色體9q31編碼的220 ku蛋白，介導細胞膽固醇的分泌，這種轉運體在巨噬細胞中大量表達[18]。ABCA1是一種膜結合蛋白，它以ATP為能源，促進細胞內膽固醇的流出，在膽固醇逆轉運和高密度脂蛋白生成過程中起重要作用[19]。本實驗結果表明，100、50 μmol/L 的EPA均能顯著上調ABCA1 mRNA的表達，這與Song Yue 等[9]的研究結果一致，Kasbi Chadli等[20]進行的動物實驗也顯示EPA干預提高了ABCA1 mRNA在倉鼠體內的表達。由于EPA能降低細胞內TC、FC、CE水平，同時可以上調ABCA1 mRNA表達，據此可推測EPA抑制THP-1細胞泡沫化的作用可能與其上調ABCA1 mRNA表達有關。

早在1999年，Ross教授[21]就在損傷反應學說的基礎上提出了“動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”的觀點。巨噬細胞調節的免疫系統參與AS病變早期炎癥反應，其介導的促炎反應是通過釋放促炎因子來實現的，最具有代表性的是IL-6和TNF-α[22]。TNF-α、IL-6激活炎癥反應，TNF-α促進LDL氧化為ox-LDL，活化單核細胞，促進細胞因子釋放；IL-6刺激T細胞和B細胞增殖，促進中性粒細胞進入血管內膜，參與AS發展[23]。本實驗結果表明，各個劑量組的EPA均能降低泡沫細胞上清液中IL-6和TNF-α的水平，且存在劑量-效應關系。這與文獻[24-25]報道的服用EPA可以抑制IL-6和TNF-α的表達，抑制病變血管炎癥反應的結果相一致。

綜上所述，EPA能夠上調ABCA1 mRNA表達，降低泡沫細胞內膽固醇的蓄積，抑制泡沫細胞的形成，降低IL-6及TNF-α這兩種炎性因子的分泌量，進而預防動脈粥樣硬化發生發展。

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Nostoc sphaeroides Phycobiliprotein Enhances Immune Functions in Mice

CHENG Chao1,2,XU Hui3,LI Wei2,ZHANG Qiuping3,WANG Xingping1,2,*
(1.Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China; 2.College of Biological Science and Technology,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China; 3.Department of Immunology,School of Basic Medical Science,Wuhan University,Wuhan 430071,China)

中圖分類號：R151.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0162-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605029 10.7506/spkx1002-6630-201605029.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：孫桂菊（1963—），女，教授，博士，研究方向為營養與慢性病。E-mail：gjsun@seu.edu.cn

作者簡介：王炎炎（1990—），女，碩士研究生，研究方向為營養與慢性病。E-mail：wangyanyan_1231@126.com

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（81001244）；南京中醫藥大學青年自然科學基金項目（13XZR16）；

收稿日期：2015-11-02