五味子多糖對兩種腸道腫瘤細胞抑制作用的影響

劉容旭，高辰哲，姜 帆，崔 憲，何 畔，董和謙，韓建春（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

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五味子多糖對兩種腸道腫瘤細胞抑制作用的影響

劉容旭，高辰哲，姜 帆，崔 憲，何 畔，董和謙，韓建春*
（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

摘 要：以五味子為原料水提多糖，經超濾、去蛋白后制得不同分子質量的五味子多糖（Schisandraceae polysaccharide，SP）組分SP1（分子質量100 ku以上）和SP2（分子質量10～100 ku），使用Caco-2和HT-29兩種腸道腫瘤細胞檢測體外抗腫瘤活性。結果表明：兩種SP干預的腫瘤細胞增殖均受到抑制，實時熒光定量實時定量聚合酶鏈式反應檢測發現Caspase-3相對表達量均出現了一定程度升高。其中SP1抑制作用較小，需較高劑量（500 μg/mL以上）孵育較長時間（72 h）才有顯著抑制效果（P＜0.05），SP2抑制作用明顯，顯著抑制所需孵育時間和劑量都更少，對Caspase-3相對表達量提升更大。實驗顯示SP具有很好的抑制腸道腫瘤增殖潛力，小分子質量組分抗癌活性更強。

關鍵詞：五味子；多糖；抗腫瘤；實時定量聚合酶鏈式反應

引文格式：

劉容旭,高辰哲,姜帆,等.五味子多糖對兩種腸道腫瘤細胞抑制作用的影響[J].食品科學,2016,37(5):192-196.

LIU Rongxu,GAO Chenzhe,JIANG Fan,et al.Inhibitory effect of Schisandraceae polysaccharides on growth of intestinal tumor cells[J].Food Science,2016,37(5):192-196.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605034.http://www.spkx.net.cn

五味子屬木蘭科植物，是一種味酸、性甘溫的健康食品，具有調節神經系統、控制血壓、改善視力和提高免疫力的作用[1-2]。近期研究也表明，五味子也有保肝[3]、抗疲勞[4-5]、抗腫瘤[6-7]、鎮痛[8]與抗氧化[9]的功效。對五味子進行藥理作用的研究表明，其抗腫瘤作用的有效成分主要是木質素和多糖[10-12]。

對五味子抗腫瘤活性成分的研究目前主要集中于肝癌細胞[13]、乳腺癌細胞[14]、胃癌細胞[15]、小鼠瘤體細胞[16]等，對于腸道腫瘤細胞的研究較少[17-18]。本實驗采用結腸腺癌細胞Caco-2和結腸癌細胞HT-29，分別研究了超濾分級不同分子質量五味子多糖（Schisandraceaepolysaccharide，SP）組分對腫瘤細胞的抑制作用，為SP抗腫瘤特性的進一步研究提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料、培養基與試劑

干燥五味子 黑龍江省北安市紅星農場；Caco-2細胞、HT-29細胞 中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

RPMI 1640培養基 美國Hyclone公司；基礎高糖培養基DMEM（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM） 美國Gibco公司。

胎牛血清 美國Hyclone公司；青鏈霉素雙抗（100×） 北京索萊寶科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（1×） 美國Gibco公司；四氮甲唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 美國Amresco公司；RNAprep pure總RNA提取試劑盒（離心柱型）、FastQuantRTKit（With gDNase）逆轉錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）熒光定量試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；濃硫酸、苯酚、石油醚、NaOH、乙醇、葡萄糖、二甲基亞砜、氯仿、正丁醇等均為國產分析純。

1.2儀器與設備

Labscale TTF System小型切向超濾系統 美國Millipore公司；Biomax Polyethersulfone小型超濾膜包×2 （10、100 ku孔徑）；721分光光度計 上海光學儀器廠；202型電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；索氏抽提器 天津市天玻儀器有限公司；超微細粉碎機 上海泰斯特儀器廠；HH-4型電熱恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；HJ-5多功能攪拌器 江蘇金壇醫療儀器廠；LG10-24A高速離心機 北京醫用離心機廠；IKA小舞靈漩渦混合器 萊貝（上海）科學儀器有限公司；全自動酶標儀WD-2102A 杭州匯爾儀器設備有限公司；XSP-6C光學顯微鏡 日本Olympus公司；CO2培養箱 日本Sanyo公司；7500實時熒光定量系統美國Life Technologies公司。

1.3方法

1.3.1SP的提取與純化

采用本課題組已報道的方法提取多糖[19]：取潔凈飽滿五味子，粉碎后烘干2 h至恒質量，使用索式抽提器脫脂12 h以上，按料液比1∶10（m/V）添加蒸餾水，4 ℃條件下浸泡6 h以上后加入NaOH緩慢調節pH值至7.0，60 ℃條件下水浴攪拌提取2 h以上，200 目尼龍紗布過濾后濾渣重復水提一遍，取兩次提取濾液4 000 r/min離心20 min除雜后取上清液，先使用100 ku孔徑超濾膜在0.207 MPa條件下超濾，收集SP1多糖（分子質量＞100 ku）截留液；透過液使用10 ku孔徑超濾膜在0.138 MPa條件下超濾，收集SP2多糖（分子質量為10～100 ku）截留液。分別對SP1、SP2截留液使用Sevag法除蛋白[20]，4 ℃條件下透析除雜后凍干。

1.3.2SP純度的檢測

使用苯酚硫酸法[21]測定總糖含量。取一定質量多糖凍干粉溶解后稀釋一定倍數依次加入1 mL質量分數為6%的苯酚溶液、5 mL濃硫酸，室溫反應30 min，漩渦振蕩器混勻后于490 nm波長處測定吸光度。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL葡萄糖標準液于150 mm×10 mm的試管中，各以蒸餾水補至2 mL，另取2 mL蒸餾水作為空白，在空白組和葡萄糖標準液中依次加苯酚、濃硫酸，橫坐標為多糖質量濃度，縱坐標為吸光度值，得出標準曲線回歸方程：y＝0.009 1x＋0.001 4 （R2＝0.998 2）計算多糖質量濃度x，從而根據多糖溶液的體積算出溶液中多糖質量，溶液中多糖質量與溶解所用的凍干粉質量之比即為多糖純度。

1.3.3Caco-2和HT-29細胞的培養

完全培養基的配制：取10 mL胎牛血清，1 mL青鏈霉素雙抗（100×），89 mL血清體積分數為10%的完全培養基（培養Caco-2細胞使用DMEM高糖培養基配制，培養HT-29細胞使用RPMI 1640培養基），使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后冷藏備用。

HT-29細胞和Caco-2細胞分別于對應的完全培養基中在37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養，大約2 d換液一次，每瓶加培養基5 mL。傳代使用0.01 mol/mL磷酸鹽緩沖液清洗后，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（1×）常溫消化3 min。取長勢良好的對數增殖期細胞用于實驗。

1.3.4MTT法檢測SP細胞增殖抑制情況

使用1.3.3節中敘述的方法，分別消化兩種細胞制成懸液，血球計數板計數，調整細胞濃度約2.5×104個/mL，取96 孔板每孔加入細胞懸液200 μL，接種培養24 h后，吸去培養基，加入配制好的含有不同濃度多糖培養液培養24、4 8、72 h，每個指標設5 個平行孔，并設不含SP的培養液組作為空白組。之后采用MTT法測定光密度（OD490 nm）值，研究SP不同組分、不同劑量對兩種腫瘤細胞的抑制率。

MTT法細胞毒性檢測采用Xu Weili等[22]的方法?，F用現配質量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，加藥過程注意避光。每孔加入20 μL MTT溶液，于CO2培養箱中放置4 h，隨后用針頭吸去全部培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜試劑，避光靜置20 min后用酶標儀在490 nm波長處檢測。

1.3.5 實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，real time-qPCR）檢測細胞凋亡基因表達

使用1.3.3節中敘述的方法，分別消化兩種對數期生長的細胞，制備懸液后計數，調整細胞濃度5×106個/mL，每孔2 mL接種于6 孔板中，培養24 h后吸去培養基，加入含有不同質量濃度多糖的培養液培養24、36、48 h。使用顯微鏡對多糖不同質量濃度、時間作用下的兩種腫瘤細胞進行觀察，然后用于總RNA的提取實驗。

1.3.5.1細胞總RNA的提取與cDNA的合成

參考RNAprep pure總RNA提取試劑盒（離心柱型）說明提取細胞總RNA。使用細胞裂解液350 μL/孔裂解細胞，將所有溶液移至過濾柱12 000 r/min離心2 min除雜，然后加入與濾液同體積70%乙醇沉淀后移至吸附柱上，經除蛋白、DNA酶水解DNA、再次去蛋白、漂洗兩次后使用RNase-Free ddH2O復融洗脫總RNA。使用紫外分光光度計分別檢測RNA提取液在260 nm和280 nm波長處的吸光度，計算OD260 nm與OD280 nm的比值，若比值介于1.8～2.0之間則可用于下步實驗。

參考FastQuantRTKit（With gDNase）逆轉錄試劑盒說明逆轉錄總RNA。取一定量總RNA提取液按比例加入gDNA buffer 42 ℃條件下孵育3 min去除基因組DNA，配制反轉錄反應體系混合液，42 ℃條件下孵育15 min，然后95 ℃條件下孵育3 min，即可逆轉錄制得cDNA用于real time-qPCR。短期4 ℃冷藏保存，長期－20 ℃冷凍保存。

1.3.5.2 real time-qPCR反應

參考SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）熒光定量試劑盒說明預實驗優化條件后進行檢測。20 μL混合體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL、下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，7.4 μL ddH2O，引物序列如表1所示。使用三步法反應程序：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，40 個循環，最后72 ℃延伸32 s（熒光信號采集），熔解曲線分析。

表1　引物合成序列Table 1 Primer sequences used for real time-qPCR

1.4數據統計

使用SPSS 13軟件對數據進行統計學分析，MTT檢驗做5 副孔平行，其他實驗均做3 組平行實驗。結果用表示，用組間方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行統計分析，采用最小差異顯著法（least-significant difference，LSD）進行顯著性比較（P＜0.05）。

2　結果與分析

2.1SP的純度鑒定

SP經過超濾分離、去蛋白處理后凍干，使用苯酚-硫酸法檢測其配制的多糖溶液總糖含量，計算不同級分SP純度：級分SP1（分子質量＞100 ku）純度可達92.32%，呈淡紅褐色；級分SP2（分子質量為10～100 ku）純度可達78.13%，呈淺黃色。兩個級分的多糖凍干粉溶解于水的速率遠優于傳統有機溶劑沉淀法制備的多糖，這可能是由于超濾在純化多糖的同時，可以起到一定的濃縮功效，直接將濃縮后的多糖冷凍干燥，多糖分子在較分散狀態下去除了周圍的水分，故組織狀態較為蓬松，復溶速率大大提高。盡管超濾可以將色素類物質部分洗脫，但所得多糖仍有一定顏色，為了不破壞多糖原有活性，故沒有使用較為劇烈的H2O2等氧化劑除色[23]，而是直接將帶有一定顏色的多糖用于細胞實驗。

2.2SP對Caco-2細胞生長抑制作用

圖1　SP對Caco-2細胞生長抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of SP1 and SP2 on the growth of Caco-2 cells

SP作用Caco-2細胞后，對細胞的存活率具有一定影響。由圖1a可知，SP1多糖不同劑量孵育條件下，24 h時細胞的存活率并未出現明顯下降，48 h個別高劑量細胞存活率有一定降低；72 h時100 μg/mL以上SP1多糖可以顯著降低Caco-2細胞的存活率，提示較大分子質量的SP1多糖需要較長時間孵育才會對Caco-2腫瘤細胞的存活率造成影響，而短時間（48 h內）孵育影響不明顯，整體抗癌活性較低。

由圖1b可知，Caco-2細胞在SP2多糖孵育24 h時，500 μg/mL以上劑量細胞存活率同空白對照組相比出現顯著下降（P＜0.05），并呈現出一定的劑量依賴性。而相同多糖劑量孵育的Caco-2細胞存活率，也隨著時間延長出現了一定下降，部分組別下降顯著。同SP1多糖組的實驗結果相比，SP2多糖500 μg/mL以上組24 h即可有顯著抑制（P＜0.05），孵育時間越長對細胞存活率影響更大。因此，更小分子質量的SP2多糖組具有更好的抑制Caco-2細胞活性。

2.3SP對HT-29細胞生長抑制作用

圖2　SP對HT-29細胞生長抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of SP1 and SP2 on the growth HT-29 cells

由圖2a可知，培養24、48 h時SP1多糖孵育的HT-29細胞存活率與空白組相比差異不顯著（P＞0.05），各相同劑量組24 h和48 h細胞存活率差異也不顯著（P＞0.05）。與此類似，HT-29細胞在72 h時，250 μg/mL以上的較高劑量作用可以對細胞存活率有顯著下調作用（P＜0.05）。在培養72 h時，SP1對HT-29細胞的抑制作用說明SP1在營養不足時，細胞較為脆弱，相同劑量的SP1多糖組分可能會對細胞的生長造成較大的影響。

由圖2b可知，SP2多糖孵育HT-29細胞，不同劑量作用時細胞存活率出現了明顯下降。當孵育24 h時，250 μg/mL以上SP2多糖劑量即可對HT-29細胞存活率造成顯著下調（P＜0.05），相比于Caco-2細胞，相同劑量SP2多糖對HT-29細胞存活率下調作用更顯著（P＜0.05），最低劑量更低（250 μg/mL），高劑量的抑制率也更大。因此，SP2多糖組分顯示出更良好的抑制HT-29腫瘤細胞活力的能力。

2.4SP處理對相關細胞凋亡基因的表達影響

細胞凋亡是一種機體在某種狀態下發生的程序化死亡過程[24]，Caspase-3是細胞凋亡時的最終效應蛋白之一[25]。它可以通過誘導細胞內部骨架蛋白的分解和剪切，從而使細胞核形成分散片段，參與形成凋亡小體，最終引起細胞的凋亡。通過real time-qPCR對Caspase-3基因表達情況的檢測，結果如圖3所示。

圖3　HT-29細胞（a）和 Caco-2細胞（b）中Cassppaassee--33基因mRNA的相對表達量變化Fig.3 Relative mRNA expression levels of caspase-3 in both HT-29 cells(a)and Caco-2 cells(b)incubated with SP1 or SP2

由圖3可知，不同劑量的SP1和SP2組分孵育，均使兩種細胞的Caspase-3基因mRNA相對表達量有一定升高。其中SP1組分孵育Caco-2細胞可以使其Caspase-3基因mRNA相對表達量比空白組略多，而各劑量間差別較小，孵育HT-29細胞則呈現出一定遞增趨勢，但相同劑量下整體mRNA表達量與SP2組相比水平較低。SP2組分各劑量Caspase-3基因mRNA相對表達量顯著高于空白組，且在兩株細胞中均呈現出隨劑量的遞增而增大的趨勢，由此可以推斷，不同劑量的SP2可以有效促進Caspase-3基因mRNA的合成，從而參與引起了兩種腫瘤細胞的凋亡。

3　結 論

SP經過超濾分級純化，較好地保留了其生物活性，同傳統柱分離法相比，產量較大，經過除蛋 白處理后兩種分子質量組分純度分別可達92.32%和78.13%，適合大規模制備用于下一步研究。

SP1組分對兩種腸道腫瘤細胞的抑制作用較SP2組分低，需在較高劑量下孵育72 h以上時才能對兩種細胞存活率產生顯著影響（P＜0.05），而SP2細胞的抗腫瘤活性較高，分別在500、250 μg/mL以上劑量時即可對Caco-2、HT-29兩種腸道腫瘤細胞的生長產生顯著的抑制作用（P＜0.05），而且呈一定的劑量依賴性，提示小分子質量的SP產品具有更高的抗癌生物活性，進一步的SP抗癌研究可以集中于10～100 ku分子質量的多糖組分。

real time-qPCR結果顯示，SP2組分的Caspase-3基因mRNA相對表達量有顯著上升趨勢，呈一定劑量依賴性，推測Caco-2和HT-29細胞的凋亡可能與Caspase-3參與的胞內凋亡途徑有關，該途徑某些關鍵酶的激活可能是SP抗癌作用的靶點所在，但其凋亡機制與具體作用位點還需要在進一步的分子生物學實驗中進行探討。

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Inhibitory Effect of Schisandraceae Polysaccharides on Growth of Intestinal Tumor Cells

LIU Rongxu,GAO Chenzhe,JIANG Fan,CUI Xian,HE Pan,DONG Heqian,HAN Jianchun*(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract:Polysaccharide components SP1 and SP2 with different molecular weights were obtained from Schisandraceae and through ultra-filtration and deproteinization.The intestinal cell lines Caco-2 and HT-29 were used to evaluate the antitumor activity of SP1 and SP2 in vitro.The results showed that the proliferation of both Caco-2 and HT-29 cells was inhibited by SP1 and SP2.Meanwhile,the increase in relative transcription level of caspase-3 was confirmed by realtime quantitative polymerase chain reaction(real time-qPCR).SP1 had no significant effect on the inhibition of tumor cell growth,except incubation for 72 h at a dose of 500 μg/mL(P < 0.05).However,SP2 showed an obvious tumor inhibitory effect even at lower dose and shortened incubation time,resulting in a more significant increase in the relative transcription level of caspase-3.In conclusion,the polysaccharides from Schisandraceae have great potential to inhibit the proliferation of intestinal tumor cells,especially the small molecular weight polysaccharide .

Key words:Schisandraceae; polysaccharides; anti-tumor activity; real-time quantitative polymerase chain reaction

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0192-05

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605034 10.7506/spkx1002-6630-201605034.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：韓建春（1973—），男，教授，博士，主要從事農產品加工研究。E-mail：hanjianchun@hotmail.com

作者簡介：劉容旭（1991—），女，碩士研究生，主要從事農產品加工研究。E-mail：923296139@qq.com

基金項目：哈爾濱市應用技術研究與開發項目（2013RFXXJ080）

收稿日期：2015-06-24