低評分胚胎的囊胚培養和移植結局

黃柳靜，許常龍，李春苑，丘映

(廣西南寧市第二人民醫院生殖醫療中心，南寧　530031)

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低評分胚胎的囊胚培養和移植結局

黃柳靜，許常龍，李春苑，丘映*

(廣西南寧市第二人民醫院生殖醫療中心，南寧530031)

【摘要】目的探討IVF/ICSI-ET中第三天(D3)低評分胚胎的囊胚培養和移植結局。方法將受精后第3天的低評分胚胎培養至囊胚期。比較不同卵裂球數的D3低評分胚胎囊胚形成情況；分析所獲得的可移植囊胚進行玻璃化冷凍-解凍-移植后的臨床結局。結果1.低評分胚胎可移植囊胚形成率30.85%；2.其中6-9細胞的胚胎囊胚形成率及可移植囊胚形成率均較高，差異有統計學意義(P<0.05)；3.2012年2月至2014年4月共解凍所形成的可移植囊胚362枚，存活314枚，囊胚復蘇率86.74%；共解凍225個周期，移植206個周期，囊胚移植后胚胎著床率為27.07%，生化妊娠率41.26%，臨床妊娠率36.41%，流產率為24.0%，活產率26.70%。低評分胚胎組的胚胎著床率(27.07% vs.44.44%)、生化妊娠率(41.26% vs.66.67%)、臨床妊娠率(36.41% vs.61.90%)、活產率(26.70 vs.47.62%)均低于優質胚胎組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論卵裂期低評分胚胎仍有可能獲得妊娠及活產兒。將卵裂期低評分胚胎用于囊胚培養，可提高胚胎利用率。對于無優胚移植或者移植優胚仍未受孕的患者，可選擇移植來源于低評分胚胎的囊胚。

【關鍵詞】低評分胚胎；囊胚；體外培養；體外受精-胚胎移植

(JReprodMed2016，25(3)：214-218)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術給許多不孕家庭帶來了福音，但也帶來了許多問題，如多胎妊娠、卵巢過度刺激、自然流產、胎兒畸形、異位妊娠等。生殖醫學界的多數醫務工作者認為囊胚培養與移植技術發展至今，已是一種提高胚胎種植率與妊娠率、減少多胎妊娠的先進技術[1-6]。冷凍前行囊胚培養可增加胚胎細胞數以及選擇最好的胚胎冷凍[7-8]。部分低評分的D3胚胎仍有繼續發育的潛能，仍可發育成為優質囊胚，移植后獲得了臨床妊娠，提高胚胎利用率[9-13]。對低評分胚胎進行體外延長培養能有效篩選出具有發育潛力的胚胎。本文探討第三天(D3)低評分胚胎繼續行體外培養囊胚的結局，并分析來源于卵裂期低評分胚胎的囊胚進行玻璃化冷凍-解凍-移植的臨床結局。

資料與方法

一、研究對象

1. 選擇2011年11月至2012年9月在本生殖醫療中心行IVF-ET或ICSI-ET助孕的患者的1 679枚低評分卵裂期胚胎，與135枚優質胚胎進行囊胚培養。

2. 比較2012年2月至2014年4月在本中心進行移植的來源于D3低評分胚胎的囊胚與來源于優質胚胎的囊胚移植后的臨床結局。

3. 材料胚胎培養液(Vitrolife，瑞士)，玻璃化冷凍液、解凍液、冷凍載體：全封閉式玻璃化冷凍載體(JIEYING，加拿大)。

二、方法

1. 受精后D3對胚胎進行評分：參照文獻 [14]評判，優質胚胎為來源于6-12cell Ⅰ-Ⅱ級胚胎，低評分胚胎為來源于1PN的4-12cellⅠ-Ⅲ級和來源于2PN的4-5 cellⅠ-Ⅱ級，6-12cell Ⅲ級胚胎。將優質胚胎用于移植或玻璃化冷凍。

2. 玻璃化冷凍：經醫院倫理委員會批準，與不孕夫婦簽署知情同意書后，將符合入選標準低評分胚胎培養至囊胚期。參考Gardner等[1]標準，于D5-6對囊胚進行評分。將D5≥3BC，D6-7≥4BC的可移植囊胚進行玻璃化冷凍。

3. 冷凍囊胚移植前內膜準備：(1)自然周期：月經規律，自然周期排卵正常者，監測優勢卵泡平均直徑大于14 mm后每日B超并抽血查LH、E2、P，LH峰為D0，排卵當天為D1，于D5行冷凍囊胚移植。(2)人工周期：月經周期不規律、無排卵者，于月經周期第3天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，廣州先靈公司)2 mg，每天2 次，共5 d，周期第8天開始改為3 mg，每天2 次，共5 d。然后開始B超監測子宮內膜厚度及查血E2，并調整戊酸雌二醇用量，最大劑量8 mg/d。當內膜厚度>8 mm，E2>200 pg/ml(732 pmol/L)，認為內膜準備好。此時予黃體酮60 mg肌肉注射，每天1 次，注射黃體酮第6天行冷凍囊胚移植。

4.黃體支持：(1)自然周期：排卵日開始予黃體酮軟膠囊(安琪坦，Laboratoires Besins-Tscovesco，法國)200 mg PV Bid+地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg Bid，用藥15 d。(2)人工周期：黃體轉化開始予黃體酮針60 mg im Qd+地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg Bid，用藥15 d。

5.生化妊娠：移植后12～14 d抽血β-HCG，陽性為生化妊娠。臨床妊娠：移植后30～35 d B超探及孕囊為臨床妊娠。流產：臨床妊娠后于28周以前發生的自然流產。

三、統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料兩樣本均數采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05，P<0.05，為差異有統計學意義。

結果

一、不同細胞數的D3低評分胚胎的囊胚形成情況

1 679個D3低評分胚胎形成囊胚864枚(形成率51.46%)，其中可移植囊胚518枚(30.85%)。6-9cell的囊胚和可移植囊胚形成率較高。三組的囊胚及可移植的囊胚形成率差異有統計學意義(P<0.001)(表1)。

二、低評分胚胎組和優質胚胎組的可移植囊胚形成情況和囊胚解凍結局

可移植囊胚形成率低評分胚胎組為30.85%(518/1 679)，優質胚胎組為52.59%(71/135)，差異有統計學意義(P<0.001)。低評分胚胎組共解凍225個周期，因胚胎復蘇差取消移植19個周期，取消率8.44%，共解凍362枚囊胚，復蘇314枚，復蘇率86.74%。優質胚胎組解凍22個周期，因胚胎復蘇差取消移植1個周期，取消率4.55%，解凍39枚囊胚，復蘇36枚，復蘇率92.31%。低評分胚胎組周期取消率高于優質胚胎組，囊胚復蘇率低于優質胚胎組，但差異均無統計學意義(P>0.05)。兩組平均移植胚胎數差異亦無統計學意義(P>0.05)(表2)。

三、低評分胚胎組和優質胚胎組解凍囊胚移植的臨床結局

低評分胚胎組：胚胎著床率27.07%(85/314)，生化妊娠率41.26%(85/206)，臨床妊娠率36.41%(75/206)，活產率26.70%(55/206)；優質胚胎組：胚胎著床率44.44%(16/36)，生化妊娠率66.67%(14/21)，臨床妊娠率61.90%(13/21)，活產率47.62%(10/21)。低評分胚胎組的胚胎著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率、活產率均低于優質胚胎組，差異均有統計學意義(P<0.05)(表3)。低評分胚胎組流產率高于優質胚胎組，但差異無統計學意義(P>0.05)(表3)。低評分胚胎組除分娩與流產以外，另有一例足月死胎引產，一例因胎兒畸形中期引產。

表1　不同細胞數來源D3低評分胚胎的囊胚

注：與4-5細胞數相比，*P<0.001；與10-12細胞數相比，#P<0.005

表2　低評分胚胎組和優質胚胎組的可移植囊胚形成率和囊胚解凍情況[(x-±s)，n〔%〕]

注：與優質胚胎組比較，*P<0.001

表3　低評分胚胎組和優質胚胎組解凍囊胚移植后的臨床結局比較[n〔%〕]

注：與優質胚胎組比較，*P<0.05

討論

隨著體外序貫培養體系的日趨成熟，囊胚培養作為國內外許多生殖醫療中心的主要胚胎培養技術，在輔助生殖技術的發展史上有著舉足輕重的意義。各個生殖醫療中心對于卵裂期低評分胚胎的處理均無統一意見。本研究將卵裂期低評分胚胎用于囊胚培養，意在了解低評分胚胎發育為囊胚的潛能，以及所形成的囊胚移植后的臨床結局。

本研究表明，在各種不同卵裂球數目的D3低評分胚胎中，6-9cell的可移植囊胚形成率最高，與許多研究[13，15]結果一致。可移植囊胚形成率低評分胚胎組為30.85%，優質胚胎組為52.59%，差異有統計學意義(P<0.001)。囊胚形成率與卵裂期胚胎形態學評分關系密切，D3胚胎質量越好，囊胚形成率越高[16]。盡管卵裂期低評分胚胎的囊胚形成率偏低，但其中仍有一部分可能發育成為囊胚甚至優質囊胚，將低評分胚胎繼續培養囊胚，可提高胚胎的利用率[17-19]。

對于D3低評分胚胎的研究，國內外多數為利用廢棄胚胎建立胚胎干細胞系，囊胚形成率為14.6%～32.6%[20-22]。本研究探討卵裂期低評分胚胎所形成的囊胚移植后的臨床結局。研究所用胚胎為1PN的4-12cellⅠ-Ⅲ級，2PN的4-5 cellⅠ-Ⅱ級、6-12cell Ⅲ級胚胎，這部分胚胎發育而來的可移植囊胚經移植后的臨床妊娠率達36.41%，與文獻[9-10，23]報道的相似。低評分胚胎與優質胚胎形成的囊胚相比較，低評分胚胎組的胚胎著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率、活產率均低于優質胚胎組，差異有統計學意義(P<0.05)。到目前為止，低評分胚胎所發育而來的囊胚移植后已分娩55個健康活嬰，活產率26.70%。流產18例，包括14例早期流產和4例晚期流產，流產率為24.00%，比國內外報道的輔助生殖技術流產率(10%～20%)偏高[24]。流產率增高可能與低評分胚胎的染色體異常有關?？傊?，卵裂期低評分胚胎經過囊胚培養有可能獲得可移植囊胚，這部分囊胚移植后有妊娠并獲得活嬰的機會。

在自然生理狀態下，胚胎于受精后6～7 d，即晚囊胚期植入子宮內膜。所以，囊胚移植與子宮內膜更具同步性，縮短了胚胎在宮腔內進一步發育與著床之間的時間間隔，更符合生理過程，因而可獲得更高的胚胎種植率及臨床妊娠率。此外，經過囊胚期的體外培養，沒有發育潛能的胚胎遭遇自然淘汰，從而可優選出具有較高發育潛能的胚胎。有能力發育至囊胚期的胚胎有著更高的著床率和臨床妊娠率[25]。所以，將卵裂期低評分胚胎經過囊胚培養篩選出可移植囊胚，對于沒有優質胚胎移植或者移植了優質胚胎仍未受孕的患者，選擇此類囊胚進行移植，可增加胚胎利用率和累積妊娠率[26]。

試管嬰兒技術經過三十多年的發展，已經被廣泛認可。但是這種非自然狀態下受孕出生的嬰兒將來的健康問題越來越受到關注。大樣本的研究表明，人類輔助生殖技術并沒有增加流產和妊娠并發癥的風險[24]。但本研究所使用的胚胎為低評分胚胎，培養囊胚后用于移植，故此類子代安全問題更應受到密切關心。與優質胚胎相比，低評分胚胎的妊娠率、著床率、活產率都偏低。本研究中低評分胚胎組的臨床妊娠中有一例足月死胎引產，胎兒死亡原因不明，產科初步考慮為臍帶繞頸。另有一例因胎兒畸形于孕中期行引產。出生的55個活嬰中，無出生缺陷發生。然而這部分嬰兒的遠期健康狀況，仍需長期追蹤調查。

綜上所述，部分卵裂期低評分胚胎仍有發育成為可移植囊胚的潛能，所形成的可移植囊胚有著床并獲得臨床妊娠及活嬰的機會。經過體外序貫培養，篩選出有發育潛能的胚胎，可更充分利用胚胎，減少胚胎的浪費，增加累積妊娠率，改善輔助生殖技術的臨床結局。

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[編輯：谷炤]

Outcome of blastocyst culture and transfer of low grade embryos

HUANGLiu-jing，XUChang-long，LIChun-yuan，QIUYing*

Reproductivemedicalcenter，theSecondPeople’sHospitalofNanning，Nanning530031

【Abstract】

Objective： To explore the outcome of blastocyst culture and transfer low-grade embryos on day 3 in IVF/ICSI-ET treatment.

Methods： The low-grade embryos on day 3 were cultured to day 5 or day 6. The blastocyst formation status was compared among the different number of blatomere of low-grade embryos on day 3. The transplantable blastocysts were process vitrification-thaw-transplantation. The clinical outcomes of blastocyst were analyzed.

Results： The transplantable blastocyst formation rate was 30.85%. The embryos with 6-9 cells had higher blastocyst or transplantable blastocyst formation rate(P<0.05). From 2012 February to 2014 April，362 blastocyst were frozen-thawed，and 314 blastocyst were revived and replaced. The blastocyst recovery rate was 86.74%. There were 225 frozen-thawed cycles and 206 transfer cycles. The blastocyst implantation rate(27.07% vs. 44.44%)，biochemical pregnancy rate(41.26% vs. 66.67%)，clinical pregnancy rate (36.41% vs. 61.90%) and live-birth rate (26.70 vs. 47.62%) in the low-grade embryos group were all significantly lower than those in high quality embryos group (allP<0.05).

Conclusions： Cleavage stage low quality embryos have the potential to achieve pregnancy and live births. It can improve the embryos utilization rate that low-grade embryos in cleavage stage are cultured to blastocyst. The patients without optimal embryo or without pregnant after high quality embryo transfer could transfer the blastocysts derived from low grade embryos.

Key words：Low grade embryo；Blastocyst；In vitro culture；IVF-ET

【作者簡介】黃柳靜，女，廣西南寧人，碩士，主治醫師，生殖醫學專業.(*通訊作者)

【基金項目】廣西科學研究與技術開發計劃項目 (桂科攻0993003A-32)

【收稿日期】2015-08-30；【修回日期】2015-11-08

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.004