不同短程硝化系統中微生物群落結構的對比分析

侯愛月,李 軍,卞 偉,王 盟,鄭林雪,張彥灼,趙昕燕 (北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室,北京 100124)

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不同短程硝化系統中微生物群落結構的對比分析

侯愛月,李 軍*,卞 偉,王 盟,鄭林雪,張彥灼,趙昕燕 (北京工業大學水質科學與水環境恢復工程北京市重點實驗室,北京 100124)

摘要：為探討有機碳源對短程硝化系統中微生物群落結構的影響,采用構建克隆文庫的方法對模擬無機城市生活污水和模擬實際城市生活污水短程硝化系統中的微生物群落結構進行對比分析.實驗結果表明,變形菌門(Proteobacteria)和未培養菌(uncultured bacterium)是兩系統中的優勢菌群.兩系統中的菌群結構存在差異,但優勢菌群及其所占比例相似.兩系統中的主要脫氮菌類群也相似,但由于有機碳源濃度的不同其菌屬及比例有所差異.無機短程硝化系統中的脫氮菌群包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和Denitratisoma,其中自養硝化菌的比例高于其在有機短程硝化系統中的比例,但仍低于異養菌在該系統中的比例.有機短程硝化系統中的脫氮菌群主要包括β-Proteobacteria中的一些反硝化細菌和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),其中亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的含量很少.

關鍵詞：有機碳源；短程硝化；克隆文庫；微生物群落結構

* 責任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn

與全程硝化相比,短程硝化可減少25％的硝化需氧量和40％的反硝化碳源,具有較低的污泥產量,并且可減少反硝化池容積[1-4],成為近幾年新型生物脫氮工藝的研究熱點.國內外有關短程硝化的研究多用于處理污泥消化液、垃圾滲濾液等高氨氮廢水[5-6],并已有工程應用,而基于城市生活污水的短程硝化研究則多局限于實驗室水平,有待于進一步深入.硝化過程是由氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)這兩種菌群的生化作用完成,可以通過控制各種影響因素促進AOB的生長繁殖而抑制NOB的生長實現短程硝化[7-8].微生物在硝化過程中起著至關重要的作用,深入研究污泥中微生物群落結構有助于加強對硝化過程機理的理解,進而為工藝的優化控制和穩定運行提供更加全面的參考和依據.

目前國內外關于短程硝化的研究多集中在短程硝化的工藝運行及優化方面,李凌云等[9]對短程硝化的啟動條件進行了優化,蘇東霞等[10]進行了不同曝氣方式SBR短程硝化試驗.有關進水水質對短程硝化系統中微生物群落結構的研究較少,趙志瑞等[11]為探討短程硝化系統中的微生物對不同污水的適應性,利用分子生物學技術對高氨氮廢水和城市生活污水短程系統中活性污泥的細菌群落結構進行了比較.C、N是生活污水中最主要的兩大污染元素,目前運用比較多的污水處理工藝(AO、AAO等)均是將硝化系統與反硝化系統分開,這樣硝化系統中主要以N源為主,反硝化系統中以C源為主.但是,隨著短程硝化技術的成熟以及對高脫氮率的追求而設置的高回流比,使得有機碳源可能進入硝化系統.另外,許多脫氮新工藝的出現,使得硝化系統與反硝化系統合二為一,比如,同步硝化反硝化(SND)和同步亞硝化-厭氧氨氧化-反硝化(SNAD)等,即C、N共存于同一系統中.因此,探討有機碳源對短程硝化系統中微生物群落結構的影響有很大的現實意義.本研究考察了有機碳源的存在對短程硝化系統中微生物群落結構的影響,并著重考察了有機碳源對常見自養硝化菌群的影響,以期為SND、SNAD等C、N共存一個系統的新工藝提供微生物基礎,利于污染去除效果的提高.

本實驗采用兩個SBR反應器,接種相同的活性污泥,進水分別為模擬無機城市生活污水和模擬實際城市生活污水,通過控制溶解氧(DO)和曝氣時間,實現穩定的短程硝化.采用構建克隆文庫的方法,對兩種短程硝化系統中的微生物群落結構進行對比分析,考察有機碳源對基于城市生活污水短程硝化系統中微生物群落結構的影響,確定優勢菌群,以期為實現可控短程硝化提供微生物群落調控方面的理論依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗采用兩個構造相同由有機玻璃制成的SBR反應器,內部設置定時攪拌裝置和精確曝氣裝置.反應器1的進水采用模擬無機城市生活污水,反應器2的進水為模擬實際城市生活污水,兩個反應器中的具體水質指標(mg/L)為:COD (CH3COONa) 200(只有反應器2中添加), NH4+-N(NH4Cl) 70,堿度(CaCO3計) 500,磷(KH2PO4) 2; 鐵(FeSO4?7H2O) 1,硼(H3BO3) 0.2,錳(MnCl2?4H2O) 0.2,鋅(ZnSO4?7H2O) 0.2,銅(CuSO4?5H2O) 0.1,鎂(MgSO4?7H2O) 0.1,鎳(NiCl2?6H2O) 0.2,鈷(CoCl2?6H2O) 0.3.兩個反應器內的接種污泥均取自北京某污水處理廠曝氣池,其硝化性能良好,f值在0.7左右,污泥指數(SVI)值在90mL/g左右,污泥濃度(MLSS)在3500mg/L左右.實驗過程中控制溫度在20～22℃,pH值在7.2～7.9,溶解氧在0.5～1mg/L,經過80個周期的運行,兩個反應器內的NO2--N積累率均達到90％以上,繼續運行30個周期, NO2--N積累率維持穩定,成功實現了短程硝化的穩定運行.在兩反應器的穩定運行時期(第110個周期),進行污泥樣品采集,對應編號樣品為R1和R2,樣品采集后在-20℃下保存.

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌總DNA提取 泥樣在1.5mL離心管中靜沉30min后去除上清液,15000r/min高速離心5min后,去除上層清液,取0.3g泥樣用于總DNA提取,剩余污泥冷凍備用.采用上海生工提供的“Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(土壤)”提取后,取5μL用1.2％瓊脂糖凝膠檢測.其余置于-20℃儲存備用.

1.2.2 聚合酶鏈式反應(PCR) 將提取的細菌總DNA作為PCR的模板,采用針對細菌16S rRNA基因的通用引物對27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增.PCR反應體系(50μL):10×PCR Buffer 5μL,dNTP(各2.5mmol/L) 1μL,27f(20μmol/L) 1μL,1492r(20μmol/L) 1μL, Taq DNA聚合酶(5U) 0.5μL,DNA模板0.5μL,加ddH2O至50μL.PCR采用降落式擴增程序,具體反應條件為:首先95℃預變性1.5min;其次95℃變性0.5min,60℃退火0.5min,72℃延伸2min,5個循環;之后95℃變性0.5min,55℃退火0.5min, 72℃延伸2min,5個循環;之后95℃變性0.5min, 50℃退火0.5min,72℃延伸2min,15個循環;最后60℃延伸10min.

將提取的細菌總DNA作為PCR的模板,采用針對AOB功能基因amoA的引物對amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)進行PCR擴增.PCR反應體系(50μL)為:10×PCR buffer 5μL,dNTP(各2.5mmol/L) 2μL,amoA-1F (20μmol/L)1μL,amoA-2R(20μmol/L) 1μL,Taq DNA聚合酶(5U) 0.5μL,DNA模板2μL,加ddH2O 至50μL.PCR反應條件為:首先94℃預變性5min;其次94℃變性30S,55℃退火1min,72℃延伸1min,35個循環;最后72℃延伸10min.

1.2.3 克隆、轉化和文庫的構建 PCR產物用上海生工提供的“SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒”進行純化后,與pMD18-T載體(Takara)連接.之后將連接產物轉入JM109感受態細胞中,涂布在含Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上,37℃下培養15h左右后進行藍白斑篩選.藍色菌落為陰性菌落,白色菌落為陽性菌落.隨機挑選一定量的白斑,用載體通用引物對RV-M(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-47(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)做菌落PCR進行假陽性的驗證,篩選出插入的片段大小正確的克隆子.

片段大小正確的PCR產物用Hha I(Takara, Japan)限制性內切酶進行酶切.酶切反應于37℃進行4h,酶切產物用3％的瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后在凝膠成像系統中成像,并根據凝膠成像結果中的酶切帶型分型,每個酶切類型挑取1～2個代表菌株送往上海生工生物公司測序.

將測序所得基因序列,去除載體片段,并利用Bellerophon軟件進行chimerae的剔除(http:// comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl).將處理后的測序基因序列輸入到NCBI網站,利用blast程序與數據庫中已有的序列進行比對鑒定,將序列比對結果相同的克隆子定義為一個操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU),并下載每個OTU代表序列的同源性序列,利用MEGA5.0軟件中的鄰接算法構建系統發育樹.

2 結果與分析

2.1 反應器運行狀況分析

兩個SBR反應器內短程硝化工藝啟動馴化和穩定運行過程中NO2--N積累率隨周期的變化情況如圖1所示.

圖1　兩個反應器中NO2--N積累率的變化Fig.1 The change of nitrogen accumulation rate in two reactors

由圖1可見,兩個反應器中NO2--N積累率均隨周期數增加而逐漸升高,運行至第80個周期, NO2--N積累率都達到90％以上,繼續運行30個周期, NO2--N積累率維持穩定,成功實現了模擬無機城市生活污水短程硝化和模擬實際城市生活污水短程硝化的穩定運行.

兩個SBR反應器中各個運行周期內的曝氣時間如表1所示.由表1可見,兩個反應器中各個運行周期內的曝氣時間均隨周期數增加而逐漸減少,但反應器2中各個周期內的曝氣時間都多于反應器1內的曝氣時間.

由圖1和表1可見,針對SBR工藝,有機碳源對短程硝化啟動所需的周期數沒有太大影響,但是會增加每個周期的運行時間,進而增加短程硝化啟動并維持穩定所需的總時間.進水中添加有機碳源,促進異養菌的生長,抑制自養硝化菌的生長,短程硝化的實現相對緩慢,在兩反應器的穩定運行時期(第110個周期),進行污泥取樣,檢測微生物種群,考察有機碳源對短程硝化系統中微生物群落結構的影響.

表1　兩個反應器中各個運行周期內的曝氣時間Table 1 Aeration time of each operation cycle in two reactors

2.2 總DNA提取與PCR擴增

污泥樣品提取的DNA進行電泳檢測,得到的總DNA片段大小約為23kb.以樣品總DNA為模板,通過引物分別對細菌16S rRNA基因和AOB amoA基因進行PCR擴增,所得到的片段大小約為1500bp和500bp,與目的基因片段長度相當,滿足后續實驗要求.

2.3 短程硝化系統中總細菌的群落結構分析

反應器1中細菌16S rRNA基因的系統發育樹如圖2所示.R1樣品的16S rDNA克隆文庫中,80個克隆子分類為24個OTUs.根據莫旭華[12]的群落結構計算方法和系統學分析,該文庫的覆蓋率為93.75％,Shannon–Weiner指數為4.25, Simpson指數為93.50％,均勻度為0.93.由圖2可以看出所有OTUs分別屬于細菌域的7個主要類群,其中,變形菌門(Proteobacteria)和未培養菌(uncultured bacterium)在文庫中所占比例最大,分別為35％和31.25％;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria),分別占17.5％和7.5％;硝化螺旋菌門(Nitrospira)、螺旋體門(Spirochaetes)、和綠彎菌門(Chloroflexi)所占比例相對較小,分別為3.75％、3.75％、3.75％、1.25％.

反應器2中細菌16S rRNA基因的系統發育樹如圖3所示.R2樣品的16S rDNA克隆文庫中,100個克隆子分類為30個OTUs.該文庫的覆蓋率為90％,Shannon–Weiner指數為4.42, Simpson指數為93.76％,均勻度為0.90.由圖3可以看出所有OTUs分別屬于細菌域的5個主要類群,其中,未培養菌(uncultured bacterium)和變形菌門(Proteobacteria)在文庫中所占比例最大,分別為43％和30％;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes),占17％;此外還含有少量的疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes),在文庫中各占比例為8％和2％.

這一結果與Snaidr等[13]的研究結果一致,即變形菌門(Proteobacteria)一直是廢水處理系統中的優勢類群.R1樣品中Proteobacteria又分為α-Proteobacteria (1.25％);β-Proteobacteria (32.5％); δ-Proteobacteria (1.25％).R2樣品中Proteobacteria又分為α-Proteobacteria (2％);β-Proteobacteria (18％); γ-Proteobacteria (7％); δ-Proteobacteria (3％).

兩系統中的另一優勢菌群為未培養菌,表明短程硝化系統中的細菌多樣性豐富,并潛藏著許多未被人們認識的微生物新資源,有待于進一步深入研究.R1樣品中未培養菌所占比例為31.25％, R2樣品中未培養菌所占比例高達40％,表明有機碳源存在的短程硝化系統中,細菌多樣性更豐富,潛藏著更多還無法估量的微生物資源,在未來的研究中還需結合純分離培養方法和其它分子生物學手段,以驗證和完善本研究的16S rDNA克隆文庫菌群結構研究.

擬桿菌門(Bacteroidetes)是兩系統中共同存在的第三大類菌群,且在兩克隆文庫中所占比例相近,表明Bacteroidetes對有機碳源的適應性較強.擬桿菌是化能有機營養菌,能夠代謝碳水化合物,降解許多復雜有機物[14].

R1樣品中特有的微生物類群為硝化螺旋菌門(Nitrospira)、酸桿菌門(Acidobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)和綠彎菌門(Chloroflexi). Nitrospira是到目前為止,很多文獻中報道的在生物脫氮過程中占主導地位的亞硝酸鹽氧化菌(NOB)[15-16].Nitrospira是自養型細菌,在與異養菌共同生存時,其自身生長周期長,沒有時空方面的競爭優勢,因而受到抑制.Tank 等[17]的研究指出Acidobacteria廣泛存在于貧營養環境中.

圖2　反應器1中細菌16S rRNA基因的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on comparison of bacteria 16S rRNA gene in reactor 1

圖3　反應器2中細菌16S rRNA基因的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on comparison of bacteria 16S rRNA gene in reactor 2

R2樣品中特有的微生物類群為疣微菌門(Verrucomicrobia)和浮霉菌門(Planctomycetes). Verrucomicrobia是新劃分出的一門細菌,含有為數不多的一些被辨別出的種類,多數在土壤和水中生存,能夠降解有機物[18].Planctomycetes是一類重要的環境微生物,對全球氮循環具有重要意義,包括化能自養型的厭氧氨氧化菌,但多數浮霉菌是化能異養型的,如Planctomyces、Pirellula、Gemmata、Isosphaera,在厭氧條件下利用有機物進行發酵作用[19].該反應器為立方體結構,空間上可能存在缺氧區域,且反應器為間歇運行,閑置時反應器為缺氧狀態,因此形成了適合此類細菌生長的環境.

2.4 短程硝化系統中脫氮功能菌的群落結構分析在構建的兩個16S rDNA克隆文庫中,變形菌都是優勢菌群,多數脫氮細菌也分布在這一類中.R2樣品中占優勢的β-變形菌綱包括索氏菌屬(Thauera)、固氮弧菌屬(Azoarcus)、德克斯氏菌屬(Derxia)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)和Denitratisoma.其中,Thauera屬細菌是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中具有反硝化及多種芳香族污染物降解能力的重要功能微生物[20];Azoarcus屬在很多的研究中被證明是反硝化條件下降解芳香族化合物的重要的微生物[21-22].該模擬實際城市生活污水實現的短程硝化系統中一些具有反硝化功能的菌群出現,說明反應器2中除了傳統的硝化途徑外,還同時存在著多種反硝化反應作用于氨氮的去除過程中.該文庫中未檢測出常見的氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB),因系統中添加有機碳源,異養菌相對于自養菌繁殖速度快,世代周期短,能夠快速的生產繁殖并大量聚集.實驗結果表明,在該有機碳源存在的短程硝化系統中,硝化細菌含量很少,異養菌仍然占絕對優勢.

R1樣品中占優勢的β-變形菌綱包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和Denitratisoma,其中代表克隆子R1-T-OTU1、R1-T-OTU2和R1-TOTU3分別與Nitrosomonas sp.(AJ224941)、Nitrosococcus mobilis(AF287297)和Nitrosomonas sp.(AB079053)的同源性為99％,且并未檢出亞硝化螺菌屬(Nitrosospira).因此,該系統中的優勢自養型氨氧化菌(AOB)屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),所占比例為22.5％.這一結果與多數研究結果相吻合,即多數污水處理系統中占優勢的AOB為Nitrosomonas[23-25].辛曉冬[26]的研究指出Denitratisoma具有反硝化性能.該系統中的優勢自養亞硝酸鹽氧化菌(NOB)屬于硝化螺菌屬(Nitrospira),所占比例為3.75％.結果表明該模擬無機城市生活污水實現的短程硝化系統中常見的自養硝化菌所占比例為26.25％,高于其在上述有機短程硝化系統中的比例,但仍低于異養菌在該系統中的比例.

圖4　反應器1中AOB amoA基因的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on comparison of amoA gene of AOB in reactor 1

為了更加全面的了解短程硝化系統中的硝化細菌,對于系統中數量較少的氨氧化菌(AOB),采用針對AOB功能基因amoA的引物對進行PCR特異性擴增,構建AOB的克隆文庫.基于amoA基因建立AOB的系統發育樹見圖4和圖5.結果表明,構建的兩個克隆文庫中所檢測出的AOB均屬于亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas).

通過構建克隆文庫的方法對兩個短程硝化系統中的脫氮菌群進行對比分析,實驗結果表明:R1系統中的脫氮菌群包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)和 Denitratisoma,其中自養硝化菌的比例為26.25％,高于其在有機短程硝化系統中的比例,但仍低于異養菌在該系統中的比例;R2系統中脫氮菌群主要包括β-變形菌綱中的一些反硝化細菌和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),其中亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的含量很少.兩個短程硝化系統中的主要脫氮菌類群相似,主要分布于β-變形菌綱,由于有機碳源濃度的不同其菌屬及比例有所差異.

圖5　反應器2中AOB amoA基因的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on comparison of amoA gene of AOB in reactor 2

3 結論

3.1 通過構建系統16S rDNA克隆文庫,對比分析了模擬無機城市生活污水和模擬實際城市生活污水短程硝化系統中的微生物群落結構,無機短程硝化系統中包括7個主要類群,按照優勢類群依次為Proteobacteria(35％),uncultured bacterium (31.25％),Bacteroidetes(17.5％), Acidobacteria(7.5％), Nitrospira (3.75％), Spirochaetes (3.75％), Chloroflexi (3.75％);有機短程硝化系統中包括5個主要類群,按照優勢類群依次為uncultured bacterium (43％), Proteobacteria (30％), Bacteroidetes (17％), Verrucomicrobia (8％), Planctomycetes (2％).

3.2 模擬無機城市生活污水和模擬實際城市生活污水短程硝化系統中的微生物群落結構存在差異,但優勢菌群及其比例相似,Proteobacteria和 uncultured bacterium是兩系統中的優勢菌群.

3.3 模擬無機城市生活污水和模擬實際城市生活污水短程硝化系統中的主要脫氮菌類群相似,由于有機碳源濃度的不同其菌屬及比例有所差異.無機短程硝化系統中的脫氮菌群包括Nitrosomonas、Nitrospira和Denitratisoma,其中自養硝化菌的比例高于其在有機短程硝化系統中的比例,但仍低于異養菌在該系統中的比例.有機短程硝化系統中的脫氮菌群主要包括β-Proteobacteria中的一些反硝化細菌和Nitrosomonas,其中Nitrosomonas的含量很少.

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Analysis of microbial community structure in different partial nitrification system.

HOU Ai-yue, LI Jun*, BIAN Wei, WANG Meng, ZHENG Lin-xue, ZHANG Yan-zhuo, ZHAO Xin-yan (Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China). China Environmental Science, 2016,36(2)：428～426

Abstract：In order to study the influences of organic carbon source on the microbial community structure in partial nitrification system, the microbial diversity was investigated in two partial nitrification reactors by the construction of bacterial clone library. The influents of two reactors were artificial wastewater with and without organic carbon source, respectively. The results indicated that Proteobacteria and uncultured bacterium were the dominant bacteria of the two studied systems. The differences existed in the structure of the bacterial community of the two systems. Nonetheless, the dominant bacteria and their proportions were similar to each other in the total clones. In addition, the main denitrifer groups were also similar in the two systems. Due to the different concentrations of organic carbon source, the denitrifer genera and their proportions were distinct. The main denitrifer genera of partial nitrification reactor with inorganic wastewater were Nitrosomonas, Nitrospira and Denitratisoma. The proportion of autotrophic nitrifying bacteria in partial nitrification reactor with inorganic wastewater was higher than that with organic wastewater. But in the reactor with inorganic wastewater, the proportion of autotrophic bacteria was lower than heterotrophic bacteria. The main denitrifer genera of partial nitrification reactor with organic wastewater were some denitrifying bacteria of β-Proteobacteria and Nitrosomonas. Additionally, the proportion of the latter in this reactor was relatively low.

Key words：organic carbon；partial nitrification；clone library；microbial community structure

作者簡介：侯愛月(1990-),女,河北張家口人,北京工業大學碩士研究生,主要從事污水生物處理研究.

基金項目：國家水體污染控制與治理科技重大專項資助項目(2014ZX07201-011)

收稿日期：2015-07-10

中圖分類號：X172

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)02-0428-09