線粒體靶向小清蛋白表達載體構建及其對肝癌細胞線粒體鈣穩態的影響

張卉，王姣姣，任婷婷，金明朋，朱劍軍，張洪新，吳有盛

(1第四軍醫大學唐都醫院，西安710026；2國家腫瘤生物學重點實驗室·第四軍醫大學基礎部教學實驗中心)

?

線粒體靶向小清蛋白表達載體構建及其對肝癌細胞線粒體鈣穩態的影響

張卉1，王姣姣2，任婷婷2，金明朋2，朱劍軍2，張洪新1，吳有盛2

(1第四軍醫大學唐都醫院，西安710026；2國家腫瘤生物學重點實驗室·第四軍醫大學基礎部教學實驗中心)

摘要：目的構建線粒體靶向小清蛋白(PVALB)表達載體，探討線粒體靶向PVALB在肝癌細胞(MHCC97H)中的表達及對線粒體內鈣穩態的影響。方法 以骨骼肌細胞的cDNA為模板，通過PCR法擴增得到PVALB，經酶切后與MTS、pcDNA3.1(+)載體連接；重組質粒經酶切分析及測序鑒定后，用脂質體轉染法轉染肝癌細胞MHCC97H，用激光共聚焦顯微鏡檢測PVALB定位及轉染后MHCC97H線粒體中鈣離子濃度。結果pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB經酶切、測序鑒定完全正確，真核表達載體構建成功；表達的MTS-PVALB定位于線粒體；MTS-PVALB可下調線粒體內鈣離子濃度。結論 成功構建pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB線粒體靶向真核表達載體，MTS-PVALB定位于MHCC97H線粒體并調節線粒體鈣穩態。

關鍵詞：肝腫瘤；小清蛋白；線粒體；鈣穩態；載體構建

線粒體的鈣穩態在細胞中起著重要的生物學作用，與細胞的凋亡、有氧代謝和活性氧的產生等緊密相關，對胞質內鈣離子信號轉導、細胞凋亡途徑的激活都具有廣泛的調控作用。研究表明，鈣穩態失調將導致線粒體功能異常，與腫瘤的發生密切相關[1,2]。小清蛋白(PVALB)是細胞內重要的水溶性鈣結合蛋白，是EF手臂鈣結合蛋白成員之一，對鈣離子具有高親和力[3]，能有效調控細胞內鈣離子交換，進而調控細胞生物學功能。線粒體靶向定位信號(MTS)，能夠引導蛋白進入線粒體。本研究擬通過構建融合MTS的PVALB真核表達載體，探討其對肝癌細胞(MHCC97H)線粒體中鈣穩態的調控作用。

1材料與方法

1.1材料pcDNA3.1(+)載體、TRIzol、Lipofectamine2000、MitoTracker?Red CMXRos、Rhod-2 AM、PVDF膜購自Invitrogen公司；高糖DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco公司； 胞質線粒體分離試劑盒(C3601)購自碧云天生物技術研究所；抗Parvalbumin (ab11427)多抗、羊抗兔二抗(ab6721)購自Abcam;限制性核酸內切酶NheⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、T4 DNA 連接酶、DNA marker DL2000購自TaKaRa公司；PCR所用的高保真DNA聚合酶購自TOYOBO公司；DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega BIO-TEK公司；蛋白質預染Marker(SM 0671)購自Thermo Scientific公司；實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；MHCC97H購自上海中科院細胞庫；293T細胞由第四軍醫大學基礎部教學實驗中心培養。

1.2目的基因獲取線粒體靶向序列按人細胞色素C氧化酶亞基Ⅷ相應合成；PVALB序列以骨骼肌細胞cDNA為模板，PCR擴增獲取；EGFP擴增以pEGFP-N2質粒為模板。PCR反應體系(50 μL)：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL、dNTPs(2 mmol/L) 5 μL、MgSO4(25 mmol/L) 3 μL、上下游引物各1.5 μL、KOD-Plus-Neo(1 U/μL) 1 μL、模板1 μL、去離子水32 μL。PCR反應條件： 94 ℃預變性2 min、98 ℃變性10 s、68 ℃退火和延伸 30 s，循環30次。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按照DNA膠回收試劑盒說明操作，回收目的PVALB、EGFP DNA片段。

1.3pcDNA3.1(+)-PVALB、pcDNA3.1(+)-EGFP表達載體構建回收的DNA片段及pcDNA3.1(+)載體用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切1 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收并定量。將酶切后的PVALB、EGFP DNA片段與pcDNA3.1(+)載體16 ℃連接過夜。將每個連接體系轉化50 μL的TOP10感受態，于37 ℃恒溫培養箱中過夜。次日挑取平板中獨立的單克隆菌落，接種于5 mL含氨芐抗性的液體LB培養基中，置37 ℃恒溫搖床中，240 r/min過夜。收集3 mL菌液，按照質粒提取試劑盒說明提取質粒并定量，并用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下片段與目的DNA大小一致的質粒載體命名為pcDNA3.1(+)-PVALB和pcDNA3.1(+)-EGFP。

1.4靶向表達載體的構建取構建好的pcDNA3.1(+)-PVALB、pcDNA3.1(+)-EGFP表達載體，用NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切2 h后，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，按照DNA膠回收試劑盒說明操作，回收酶切后的載體并定量。各取酶切后的載體與退火后的MTS 16 ℃連接過夜。 按照之前方法轉化連接產物，并挑取單克隆菌落，擴增，提取重組后質粒載體，用NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切1 h，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下片段與目的DNA大小一致的質粒命名為pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB、pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP。按上述方法，用BamHⅠ和NheⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB，插入EGFP序列，構建pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB -EGFP真核表達載體。

1.5MHCC97H中MTS-PVALB融合蛋白表達定位將MHCC97H以5×105/孔接種于6孔板內，24 h后使用Lipofectamine 2000轉染試劑(8 uL/孔)轉染融合表達pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP、pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB -EGFP載體(4 μg/孔)。24 h后消化、重懸、計數，再取適量細胞接種于激光共聚焦專用培養皿中。待細胞貼壁后，使用HBSS洗滌3次，在各培養皿底部加入200 μL濃度為250 nmol/L(用37 ℃預熱HBSS稀釋)Mito Tracker?Red 染料，37 ℃，染色25 min，HBSS清洗3次，使用Olympus (FV1000)共聚焦顯微鏡拍照。

1.6MHCC97H線粒體中MTS-PVALB融合蛋白定位檢測按照碧云天細胞線粒體分離試劑盒說明，提取轉染了pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB和pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP的MHCC97H細胞線粒體及去除線粒體的胞質蛋白(細胞數約5×107個)，用150 μL細胞全蛋白裂解液(含Sodium Vanadate 2 mmol/L、Aprotinin 1 μg/mL、leupetin 1 μg/mL、PMSF 1 mmol/L)裂解提取的線粒體，胞質蛋白和線粒體蛋白測定濃度。檢測時取等質量蛋白上清25 μL，加5 μL 6×還原型上樣緩沖液煮沸10 min，使蛋白變性，12 000 r/min離心5 min，取上清和預染Marker用15%的SDS-PAGE凝膠加樣電泳，Western blotting法檢測蛋白。

1.7MHCC97H線粒體中鈣離子動態檢測將轉染pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP真核表達載體及轉染了pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB真核表達載體的MHCC97H分別接種于共聚焦專用培養皿中，待細胞貼壁后，用濃度為 4 μmol/L的 Rhod-2 AM熒光染料，37 ℃染色30 min后，用HBSS清洗3次，再次置于37 ℃繼續孵育30 min。使用Olympus熒光顯微鏡檢測細胞，激發波長545 nm，發射波長565 nm。使用專用軟件，拍照設置間隔1張/s×500張，達到1 min基線后加入10 μmol/L組胺，記錄熒光強度曲線并加以分析。

2結果

2.1真核表達載體構建結果PCR法擴增的PVALB 和EGFP片段的產物經電泳后鑒定分別為330 bp 和720 bp，與預期大小一致。構建的真核表達載體pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB、pcDNA3.1(+)-MTS-EGFP、 pcDNA3.1(+)-MTS-PVALB-EGFP經限制性內切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小與預期大小一致，證明目的基因已成功連接到載體中，經進一步測序確認，所構建的載體序列、目的基因融合順序均正確。

2.2MTS-PVALB融合蛋白的定位情況MTS特異性地引導蛋白定位于線粒體。本實驗中構建的表達載體轉染細胞后，融合蛋白可正常表達。激光共聚焦顯微鏡拍照結果表明，表達的融合蛋白精確定位于線粒體中。

2.3PVALB對細胞內鈣穩態的影響表達MTS-PVALB融合蛋白的MHCC97H內鈣離子濃度降低，在組胺誘導細胞內鈣震蕩后，可很好地調節細胞內鈣穩態，震蕩幅度變小，防止線粒體鈣超載。見圖1。

圖1　MTS-PVALB調節MHCC97H線粒體內鈣濃度動態曲線

3討論

線粒體鈣穩態與細胞的生物學功能密切相關，影響細胞的能量代謝和活性氧的產生，對胞質內鈣離子信號和震蕩發揮緩沖作用，調控細胞的凋亡途徑[4，5]。無論是分離的還是體內的線粒體都可以自發吸收和釋放鈣離子，在維持細胞鈣穩態中起到非常重要的作用[6]。鈣超載容易導致線粒體損傷，誘導細胞凋亡和炎癥發生[7，8]，鈣穩態的失調可導致線粒體功能紊亂，因此維持合適鈣離子水平對細胞正確發揮功能必不可少。

線粒體鈣穩態的調控涉及鈣的吸收、釋放和存儲。最近研究發現，定位于線粒體內膜的分子線粒體鈣離子單向轉運蛋白(MCU)及其受體(MCUR1)能夠正向調節線粒體鈣離子攝取，促進線粒體鈣離子內流，提高線粒體對胞質鈣離子的緩沖能力[9，10]。與Parvalbumin蛋白一樣，線粒體鈣離子調節蛋白具有兩個典型的EF-hand結構域，可感知鈣離子的變化，作為調控線粒體鈣攝入的重要分子，其表達與功能發揮是調節線粒體鈣穩態的關鍵。原發性肝癌組織中MCUR1蛋白表達異常增高，提示MCUR1異常表達可能與肝癌惡性發展相關。有研究也發現，線粒體鈣攝入減少能夠增強腫瘤細胞對于凋亡誘導劑的抵抗能力[11]。這些研究都反映了線粒體鈣穩態與腫瘤發生相關。

Parvalbumin是細胞內對鈣離子具有高親和力的鈣結合蛋白，是EF-hand鈣結合蛋白成員之一，是細胞內鈣離子緩沖系統重要組成部分[12，13]，主要表達于骨骼肌細胞和少數神經元細胞中。Parvalbumin在神經元分布與γ-氨基丁酸能神經元的分布高度一致，可能與神經沖動傳遞、短期突觸可塑性、抑制性神經遞質釋放等有關[14,15]。MTS能夠引導融合蛋白進入線粒體，本研究中構建了MTS-PVALB融合蛋白真核表達載體，實現了目的蛋白定位于線粒體中，表達MTS-PVALB融合蛋白的細胞內鈣離子濃度降低，在組胺誘導細胞內鈣震蕩后，可很好地調節細胞內鈣穩態，震蕩幅度變小，降低鈣波的傳播幅度和速度，防止線粒體功能異常。

參考文獻：

[1] Boland ML, Chourasia AH, Macleod KF. Mitochondrial dysfunction in cancer[J]. Front Oncol, 2013,3:292.

[2] 張百紅,岳紅云.線粒體在腫瘤發生中的作用[J].國際腫瘤學雜志,2013,40(7):486-488.

[3] 農小獻,賓石玉,蒙濤,等.小清蛋白研究進展[J].生物技術通訊,2011,22(6):887-891.

[4] Hoppe UC. Mitochondrial calcium channels[J]. FEBS Lett, 2010,584(10):1975-1981.

[5] 徐歡成，鄭明學，古少鵬，等.鈣信號轉導對細胞凋亡的影響[J].動物醫學進展，2013,34(1):112-115.

[6] 陸久維,翟宇佳,孫飛.線粒體鈣離子轉運的研究進展[J].生物物理學報,2013,29(3):167-180.

[7] 唐海林，蘇琦.鈣離子信號與細胞凋亡關系的研究進展[J].南華大學學報(醫學版),2006,34(5):663-666.

[8] 齊卡,馮哲,洪權,等.尿酸通過誘導線粒體鈣穩態失衡介導內皮細胞炎癥反應[J].山東醫藥,2010,50(20):15-18.

[9] Mallilankaraman K, Doonan P, Cárdenas C, et al. MICU1 is an essential gatekeeper for MCU-mediated mitochondrial Ca2+uptake that regulates cell survival[J]. Cell, 2012,151(3):630-644.

[10] 郭曉強，計惠民.線粒體鈣離子單向轉運蛋白MCU及調節蛋白MICU1[J].生命的化學,2012,32(3):228-230.

[11] Tina Pangrsic, Mantas Gabrielaitis, Susann Michanski, et al. EF-hand protein Ca2+buffers regulate Ca2+influx and exocytosis in sensory hair cells[J]. PNAS, 2015,112(9):E1028-E1037.

[12] Henzi T, Schwaller B. Antagonistic regulation of parvalbumin expression and mitochondrial calcium handling capacity in renal epithelial cells[J]. PLoS One, 2015,10(11):e0142005.

[13] Marchi S, Lupini L, Patergnani S, et al. Downregulation of the mitochondrial calcium uniporter by cancer-related miR-25[J]. Curr Biol, 2013,23(1):58-63.

[14] 顏焱華，鄭德樞.鈣結合蛋白Parvabmin(小白蛋白)及其在中樞神經系統中的分布[J].神經解剖學雜志,1992,8(1):17-22.

[15] Ellender TJ, Raimondo JV, Irkle A, et al. Excitatory effects of parvalbumin-expressing interneurons maintain hippocampal epileptiform activity via synchronous afterdischarges[J]. J Neurosci, 2014,34(46):15208-15222.

Construction of mitochondria targeted parvalbumin expressing vector and its effect on mitochondrial calcium homeostasis of hepatocellular carcinoma cells

ZHANGHui1,WANGJiaojiao,RENTingting,JINMingpeng,ZHUJianjun,ZHANGHongxin,WUYousheng

(1TangduHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710026,China)

Abstract:ObjectiveTo construct mitochondria targeted parvalbumin (PVALB) expression vector and to investigate the mitochondrial targeting PVALB expression in human hepatocellular carcinoma cells MHCC97H and its effect on mitochondrial calcium homeostasis. MethodsUsing skeletal muscle cells cDNA as the template, the PVALB was amplified by PCR, and then the digested PVALB was connected with MTS and pcDNA3.1 (+) vector. After identifying by enzyme digestion analysis and sequencing, the recombinant plasmid was transfected into MHCC97H by liposome. The expression and localization of PVALB, calcium concentration in MHCC97H were detected by laser scanning confocal microscopy after transfection. ResultspcDNA3.1 (+)-MTS-PVALB was successfully constructed and was verified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of MTS-PVALB was located in the mitochondria, and MTS-PVALB could down-regulate the concentration of calcium. ConclusionpcDNA3.1 (+)-MTS-PVALB was successfully constructed. The expressed MTS-PVALB was located in MHCC97H mitochondria and regulated mitochondrial calcium homeostasis.

Key words:liver neoplasms; parvalbumin; mitochondria; calcium homeostasis; vector construction

(收稿日期：2015-12-28)

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0004-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.002

通信作者簡介：張洪新(1966-)，男，博士，教授，主要研究方向為腫瘤防治。E-mail:zhhxtdjr@163.com吳有盛(1975-)，男，碩士，實驗師，主要研究方向為線粒體生物學及腫瘤防治。E-mail:wuys@fmmu.edu.cn

作者簡介：第一張卉(1988-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤代謝。E-mail:grass1010@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81572727；81572304)。