肺癌腫瘤抑制因子1對(duì)膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用及機(jī)制

王尚任，陳業(yè)剛，楊永姣，劉莉，劉曉強(qiáng)，陳少峰，孫光

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所)

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肺癌腫瘤抑制因子1對(duì)膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用及機(jī)制

王尚任1，陳業(yè)剛1，楊永姣1，劉莉2，劉曉強(qiáng)1，陳少峰1，孫光1

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所)

摘要：目的觀察肺癌腫瘤抑制因子1(TSLC1)對(duì)膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。方法 將TSLC1過表達(dá)人膀胱癌T24細(xì)胞株(Ad-TSLC1-T24組)、空載體對(duì)照T24細(xì)胞株(Ad-T24組)及空白對(duì)照T24細(xì)胞株(T24組)種植于裸鼠皮下，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，種植細(xì)胞5周處死全部裸鼠留取腫瘤組織標(biāo)本，測(cè)量腫瘤體積，稱量瘤重，計(jì)算抑瘤率，光鏡觀察移植瘤組織病理變化，RT-PCR法檢測(cè)移植瘤組織中TSLC1、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)移植瘤組織中TSLC1、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示Ad-TSLC1-T24組移植瘤生長(zhǎng)明顯慢于Ad-T24組及T24組，種植細(xì)胞5周Ad-TSLC1-T24組腫瘤體積及質(zhì)量低于Ad-T24組及T24組(P均<0.05)，抑瘤率高于Ad-T24組(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示，Ad-TSLC1-T24組移植瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的核固縮、核碎裂等凋亡現(xiàn)象。與Ad-T24組、T24組比較，Ad-TSLC1-T24組移植瘤中TSLC1、Caspase-3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，Bcl-2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)。結(jié)論 TSLC1過表達(dá)可抑制膀胱癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與上調(diào)Caspase-3表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：膀胱腫瘤；肺癌腫瘤抑制因子1；移植瘤；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3

肺癌腫瘤抑制因子1(TSLC1)是一種抑癌基因，是細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成員。TSLC1表達(dá)缺失與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，TSLC1表達(dá)的異常與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后存在密切關(guān)系。2014年11月~2015年1月本研究將過表達(dá)TSLC1基因的T24膀胱癌細(xì)胞系種植于裸鼠皮下，觀察TSLC1在體內(nèi)環(huán)境下對(duì)膀胱癌移植瘤生長(zhǎng)的影響，探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料人膀胱癌慢病毒介導(dǎo)的TSLC1過表達(dá)T24細(xì)胞株(Ad-TSLC1-T24)及空載體對(duì)照T24細(xì)胞株(Ad-T24)由上海漢恒生物公司構(gòu)建。BALB/c雌性裸鼠18只(體質(zhì)量15~20 g、5周齡)購買于中國食品藥品檢定研究所，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所。總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國GeneCopoeia公司。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。鼠抗人TSLC1單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)單克隆抗體購自美國Abnova公司，二抗羊抗鼠IgG抗體、GAPDH內(nèi)參抗體及BCA蛋白測(cè)定試劑盒購自中國康為世紀(jì)公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物模型建立將Ad-TSLC1-T24、Ad-T24、空白對(duì)照T24培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL，用于接種裸鼠。18只裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別接種Ad-TSLC1-T24(Ad-TSLC1-T24組)、Ad-T24(Ad-T24組)、T24(T24組)，各自取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于裸鼠前肢肩胛部皮下。

1.3膀胱癌移植瘤生長(zhǎng)情況觀察腫瘤形成后每隔5天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑與短徑,記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。接種細(xì)胞5周，采用脫頸法處死全部裸鼠，迅速完整剝離腫瘤，測(cè)量腫瘤體積，并利用微量天枰稱量瘤重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率(%)=(空白組腫瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量)/空白組腫瘤質(zhì)量×100%。

1.4移植瘤病理變化觀察取各組部分移植瘤標(biāo)本，使用10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，制成5 μm切片，再經(jīng)烤片、脫蠟、HE染色、脫水、封片等操作后完成病理制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組移植瘤病理改變。

1.5移植瘤組織TSLC1、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法。取各組部分移植瘤標(biāo)本，嚴(yán)格按照總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)采用10 μL體系，以管家基因GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)化樣品，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，TSLC1上游引物為5′-CCCCAGCCTGTGATGGTA-3′、下游引物為5′-GGATAGTTGTGGGGGGATCGT-3′，Bcl-2上游引物為5′-GTATGATAACCGGGAGATCG-3′、下游引物為5′-AGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′，Caspase-3上游引物為5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′、下游引物為5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′，GAPDH上游引物為5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′、下游引物為5′-AGCCTTCTCC ATGGTGGTGAAGAC-3′，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Ct值表示，每組標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，待測(cè)樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt。ΔCt=待測(cè)樣品目的基因Ct值-待測(cè)樣品GAPDH Ct值。

1.6移植瘤組織TSLC1、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。取各組移植瘤組織，在冰上裂解勻漿，4 ℃離心，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后將各組蛋白濃度調(diào)至同一水平，配制分離膠及濃縮膠，蛋白加熱變性后每孔加入40 μg進(jìn)行電泳，電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉過夜，室溫孵育一抗(1∶1 000)2 h，洗膜，室溫孵育二抗(1∶5 000)1.5 h，洗膜，以GAPDH作為內(nèi)參，用新鮮配制的ECL發(fā)光液均勻覆蓋于膜上，反應(yīng)5 min，凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影、定影。使用Image-Pro Plus 5.0軟件分析蛋白表達(dá)的灰度值，與內(nèi)參基因比較計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1TSLC1對(duì)人膀胱移植瘤生長(zhǎng)的影響3組抑制瘤體積生長(zhǎng)曲線見圖1，Ad-TSLC1-T24組移植瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于Ad-T24組、T24組，Ad-T24組、T24組腫瘤生長(zhǎng)速度比較差異不明顯。接種細(xì)胞5周，T24、Ad-TSLC1-T24、Ad-T24組腫瘤體積分別為(1 851±405)、(985±264)、(1 687±326)mm3，腫瘤質(zhì)量分別為(2.1±0.9)、(1.1±0.4)、(1.8±0.5)g；Ad-TSLC1-T24組腫瘤體積、質(zhì)量均低于T24、Ad-T24組，P均<0.05；T24組與Ad-T24組腫瘤體積、質(zhì)量比較，P均>0.05。Ad-TSLC1-T24組抑瘤率為47.6%，Ad-T24組抑瘤率為14%，兩組比較，P<0.05。

圖1　3組移植瘤體積生長(zhǎng)曲線

2.2各組移植瘤病理改變Ad-TSLC1-T24組移植瘤細(xì)胞生長(zhǎng)較差，細(xì)胞大小不一，形態(tài)不整，細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮及核碎裂等凋亡表現(xiàn)，T24組及Ad-T24組移植瘤細(xì)胞生長(zhǎng)較好。

2.3各組裸鼠移植瘤組織中TSLC1、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較見表1。

表1　各組移植瘤組織中TSLC1、Bcl-2及Caspase-3

注：與Ad-TSLC1-T24組比較，*P<0.05。

2.4各組裸鼠移植瘤組織中TSLC1、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較見表2。

表2　各組移植瘤組織中TSLC1、Bcl-2及Caspase-3 蛋白的

注：與Ad-TSLC1-T24組比較，*P<0.05。

3討論

膀胱癌是泌尿外科臨床常見的腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多階段、多環(huán)節(jié)的病理變化過程，在非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中有55%~60%的患者在治療后復(fù)發(fā)或進(jìn)展，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，是膀胱癌臨床治療中面臨的主要難題[1,2]。因此，對(duì)膀胱癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，尋找能夠用于膀胱癌早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)或治療的腫瘤分子標(biāo)志物仍是目前研究的重點(diǎn)之一。

TSLC1是Gomyo等在1999年分析人染色體11q23.2區(qū)域發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因。TSLC1屬于免疫球蛋白超家族，可轉(zhuǎn)錄4.4 kb或1.6 kb的前體mRNA，翻譯成442個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白。TSLC1蛋白胞外區(qū)含有373個(gè)氨基酸，并由二硫鍵連接形成3個(gè)免疫球蛋白C2型結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)為一疏水性的α螺旋結(jié)構(gòu)域，胞質(zhì)區(qū)羧基端為PDZ和FERM結(jié)合模體，TSLC1通過PDZ模體與MPP3蛋白相互作用、通過FERM結(jié)合模體與DAL-1/4.1B蛋白發(fā)生作用，激活下游信號(hào)通路，參與細(xì)胞間黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)效應(yīng)[3~5]。TSLC1的失活或異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6~8]，TSLC1通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡起到抑癌作用，并可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附、改變腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)特性、抑制上皮間轉(zhuǎn)化，在抑制上皮來源的惡性腫瘤中起重要作用[9,10]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，TSLC1基因在膀胱癌組織中低表達(dá)，并與膀胱癌的分級(jí)分期及侵襲能力密切相關(guān)[2]，并證實(shí)TSLC1啟動(dòng)子甲基化與TSLC1的失活關(guān)系密切[11]。目前，TSLC1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，TSLC1過表達(dá)可明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，TSLC1過表達(dá)組膀胱癌移植瘤體積和質(zhì)量明顯低于其他兩組，抑瘤率為47.6%；光鏡觀察顯示腫瘤細(xì)胞的增殖受到限制，并出現(xiàn)核固縮、核碎裂等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。說明TSLC1的過表達(dá)可引起膀胱癌腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡受多種基因的調(diào)控，與Caspases家族和Bcl-2家族密切相關(guān)， Caspases-3在細(xì)胞凋亡通路中處于中心環(huán)節(jié)，其活化后能特異性切割蛋白底物的氨基酸序列，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5,8]。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3參與了腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞凋亡異常的變化[12]。Bcl-2是一種癌基因，具有阻斷細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2的過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可使DNA受損的細(xì)胞持續(xù)生存，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13,14]。目前認(rèn)為Bcl-2可作用于Caspase-3的上游通路，從而抑制Caspase-3作用的發(fā)揮[12,15]。本研究通過過表達(dá)TSLC1基因的T24細(xì)胞系構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，并利用RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)裸鼠移植瘤中Caspase-3、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)的變化，探究TSLC1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果顯示，TSLC1過表達(dá)的同時(shí)伴隨著Bcl-2表達(dá)量的降低及Caspase-3表達(dá)量的升高，因此我們推斷，TSLC1過表達(dá)可以下調(diào)Bcl-2表達(dá)并上調(diào)Caspase-3表達(dá)，從而促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的凋亡，抑制了膀胱癌移植瘤生長(zhǎng)。然而，TSLC1發(fā)揮抑癌作用的具體機(jī)制及其分子通路尚需進(jìn)一步研究。

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(收稿日期：2015-10-22)

中圖分類號(hào)：R737.14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)09-0034-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.012

通信作者：劉曉強(qiáng)(E-mail:xiaoqiangliu1@163.com)

基金項(xiàng)目：天津市科委自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(12JCZDJC23700)。