抗人胸腺免疫球蛋白聯合干擾素γ和白介素2誘導培養細胞因子誘導的殺傷細胞的效果*

黃建敏, 闞全程, 張　震, 楊雙寧，趙　璇，李　紅，王麗萍，張　毅#

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052　3)鄭州大學生物工程系 鄭州 450001　4)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

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抗人胸腺免疫球蛋白聯合干擾素γ和白介素2誘導培養細胞因子誘導的殺傷細胞的效果*

黃建敏1), 闞全程2), 張震1,3), 楊雙寧1)，趙璇1)，李紅1)，王麗萍4)，張毅1,3)#

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 4500522)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 4500523)鄭州大學生物工程系 鄭州 4500014)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052

關鍵詞細胞因子誘導的殺傷細胞；抗人胸腺免疫球蛋白；干擾素γ；白介素2

摘要目的：探討抗人胸腺免疫球蛋白(ATG)誘導培養的細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的活性和功能,為CIK培養體系優化提供依據。方法：采集9例腫瘤患者外周血10 mL，分離單個核細胞，用CD3單抗或ATG(50、250、500 μg/L)聯合干擾素γ、白介素2誘導培養。培養至第6～10天，采用流式細胞術檢測細胞增殖狀況，培養至第13天，采用流式細胞術檢測CIK免疫表型(CD3、CD4、CD8、CD56)、激活性表面標志(CD28、CD27、CD69、NKG2D)、抑制性表面標志(PD1、CD152)及Granzyme-B、干擾素γ分泌量。結果：4種培養方式下，細胞增殖狀況無統計學意義(P>0.05)。與CD3單抗相比，ATG培養的CIK中CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞比例較低(P<0.001)，CD3-CD56+與CD8+CD69+細胞比例較高，CD56+細胞干擾素γ和Granzyme-B分泌水平較高。結論：ATG誘導的CIK免疫活性優于用CD3單抗經典方案培養的CIK，抗腫瘤能力較強。

Function and activity of cytokine induced killer cells induced by anti-human thymocyte immunoglobulin combined with interferon γ and IL-2

HUANGJianmin1),KANQuancheng2),ZHANGZhen1,3),YANGShuangning1),ZHAOXuan1),LIHong1),WANGLiping4),ZHANGYi1,3)

1)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofPharmacology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)SchoolofBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500524)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordscytokine induced killer cell;anti-human thymocyte immunoglobulin;interferon γ;interleukin-2

AbstractAim: To investigate the activity and function of the cytokine induced killer cells(CIK) cultured by anti-human thymocyte immunoglobulin(ATG) combined with recombinant human interferon γ(IFN-γ) and recombinant human interleukin-2(IL-2).Methods: The peripheral blood(10 mL) was collected from 9 cancer patients. The peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were isolated by Ficoll density gradient centrifugation, and then were cultured with anti CD3 monoclonal antibody or different concentration(50,250,500 μg/L) of ATG combined with IFN-γ and IL-2. Cell proliferation was assessed using flow cytometry from D6 to D10. At the 13th day,the phenotype(CD3,CD4,CD8,CD56), the expressions of activated markers(CD28,CD27,CD69 and NKG2D) and inhibitory markers(PD1 and CD152), as well as the levels of IFN-γ and Granzyme-B secretion were analyzed by flow cytometry. Results: Compared with anti-CD3 group, the proportions of CD3+CD4+cells and CD3+CD8+cells were lower in ATG groups(P<0.001), while the percentages of CD3-CD56+natural killer cells and CD8+CD69+cells were elevated significantly in ATG groups(P<0.05). Furthermore, the levels of IFN-γ and Granzyme B secretion of CD56+cells in all ATG groups were higher than that of anti-CD3 group(P<0.05). Conclusion: The CIK induced by ATG instead of CD3 monoclonal antibody combined with IFN-γ and IL-2 exhibit better immune-competence and enhanced cytotoxic activity.

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)免疫治療目前是臨床廣泛應用的腫瘤過繼免疫治療方法之一。CIK培養的經典方法是將少量患者外周血單個核細胞用抗CD3單克隆抗體聯合重組人干擾素γ(recombinant human interferon γ， IFN-γ)、重組人白介素2(recombinant human interleukin-2，IL-2)培養14 d。這種方法培養的CIK具有增殖快、抗腫瘤譜廣的特點，但其活性和功能還需要進一步增強和提高。目前,對CIK細胞培養體系進行優化，增強其活性和功能的報道較少。作者采用抗人胸腺細胞免疫球蛋白(anti-human-thymocyte immunoglobulin，ATG)代替抗CD3單克隆抗體誘導培養CIK，觀察其對CIK細胞表型、增殖和功能的影響。

1材料與方法

1.1標本來源9例惡性腫瘤患者均來自鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科。其中肺癌2例，結腸癌1例，胃癌1例，食管癌1例，胰腺癌1例，前列腺癌1例，腎癌1例，膀胱癌1例。標本在征得患者同意并簽訂知情同意書后采集。

1.2藥品、試劑和儀器流式細胞儀FASCanto Ⅱ購自美國 BD公司，各種免疫熒光抗體購自美國BD Pharmingen公司，ATG購自法國IMTIX-SANGSTAT 制藥公司，抗CD3單克隆抗體購自以色列Prospecbio公司，Hyclone RPMI 1640培養基購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司，胎牛血清購自Gibco 公司，IL-2購自北京雙鷺藥業股份有限公司， IFN-γ購自上海凱茂藥業有限公司，Ficoll-Plaque淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物高科技術有限公司，Annexin V/PI試劑盒購自北京碧云天公司，佛波酯(phorbol-12-mirystate-13-acetate,PMA)和離子霉素購自Sigma 公司，阻斷劑brefeldin A solution(BFA)購自 Biolegend 公司。

1.3實驗分組無菌條件下采集腫瘤患者的外周血10 mL(肝素抗凝)，采用Ficoll-Plaque淋巴細胞分離液進行密度梯度離心(2 500 r/min，25 min)，提取白膜層，PBS洗滌后重懸于RPMI 1640培養基中，調整細胞密度為2×106mL-1，分4組培養。4組細胞加入IFN-γ(1 000 U/mL)，置于37 ℃、體積分數為5%CO2的培養箱中培養24 h，然后CD3(對照)組和ATG1組、ATG2組、ATG3組分別加入抗CD3單克隆抗體(25 μg/L) 和50、250、500 μg/L的ATG，再加入IL-2(1 000 U/mL)繼續培養，每隔2～3 d換液并補加完全培養基及IL-2。

1.4CIK增殖的檢測培養至第6天時，取各組細胞1×106個，離心洗滌后加入無血清培養基1 mL,避光加入5 mmol/L乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)1 μL，37 ℃孵育15 min，加入體積分數10%胎牛血清終止反應，4 ℃ 放置8 min，PBS洗滌2次(將未結合的CFSE洗去)，分別加入相應培養基1 mL,重懸于24孔板中。各組取100 μL用流式細胞儀進行母本細胞CFSE熒光信號的檢測，連續檢測5 d。用Modifit軟件分析細胞的增殖指數。

1.5CIK免疫表型及主要表面標志物的檢測培養至第13天，取各組細胞，加入免疫熒光標記抗體或相應的同型抗體，混勻后室溫避光孵育15 min，加入PBS離心(1 500 r/min,5 min)、洗滌，PBS重懸后上流式細胞儀檢測細胞免疫表型(CD3、CD4、CD8、CD56),激活性表面標志(CD28、CD27、CD69、NKG2D)和抑制性表面標志(PD1、CD152)。

1.7統計學處理采用Prism 5.0進行統計分析，4組細胞各監測指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.14組CIK的增殖情況4組細胞均于培養至第4天時開始增殖，于第6天后開始檢測細胞增殖指數，結果見圖1。4組細胞增殖指數差異無統計學意義(第6天：F=0.056，P=0.982；第7天：F=0.108，P=0.955；第8天：F=0.225，P=0.878；第9天：F=0.316，P=0.813；第10天：F=0.230，P=0.874)。

圖1　4組CIK的增殖曲線

2.24組CIK免疫表型的比較見表1、2。培養至第13天，ATG各組CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞比例較低， CD3-CD56+NK細胞比例較高；而4組CD3+CD56+T細胞比例差異無統計學意義。

表1　4組CIK的免疫表型(1)　%

*:與CD3組比較，P<0.05;ATG各組間比較,P>0.05。

表2　4組CIK的免疫表型(2)　%

*:與CD3組比較，P<0.05;ATG各組間比較,P>0.05。

2.34組CIK表面標志物表達的比較與CD3組比較， ATG各組CD8+CD69+細胞比例較高,CD8+NKG2D+細胞比例有升高的趨勢,見表3。4組其他表面標志物的表達差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3　4組CIK表面標志物的表達　%

*：與CD3組比較，P<0.05；ATG各組間比較，P>0.05。

2.44組CIK IFN-γ和Granzyme-B 分泌量的比較見表4。培養至第14天，與CD3組相比， ATG各組CD56+細胞Granzyme-B和IFN-γ分泌量更高。

表4　4組CD56+CIK

*：與CD3組比較，P<0.05；ATG各組間比較，P>0.05。

3討論

目前，腫瘤免疫治療已成為繼手術、放療和化療之后的第四種腫瘤治療方法，其中，CIK免疫治療因其效應細胞體外擴增速度快、殺瘤譜廣而成為腫瘤細胞免疫治療中應用最廣泛的方法之一，在多種常見腫瘤如惡性黑色素瘤、腎癌、乳腺癌和鼻咽癌的治療中取到了良好的療效[1-5]。目前認為，CIK是一群異質性細胞，發揮抗腫瘤效應的細胞有CD3+CD56+、CD3-CD56+、CD3+CD8+細胞，其中CD3+CD56+細胞抗腫瘤活性最強[6]。

此次研究發現，不同劑量ATG培養的CIK中，CD3+CD4+細胞比例低于抗CD3單克隆抗體誘導組，而CD3-CD56+NK細胞比例升高，這一結果與Bonanno等[7]報道相符。Bonanno等[7]的研究還顯示ATG誘導的CIK中調節性T細胞(Treg)的含量較抗CD3抗體誘導組低。Treg細胞主要是一群CD4+CD25+FOXP3+且具有免疫抑制功能的細胞，CD4+細胞的總體含量降低也代表這群免疫抑制細胞的數量減少，這將有利于CIK在體內發揮抗腫瘤免疫作用[8]。CD69是一個細胞活化的標志，CD8+CD69+是一群可以發揮免疫殺傷作用的活化細胞[9]。該研究中，ATG組此類細胞比例高于CD3組，也從另一個方面預示ATG誘導的CIK具有更強的殺傷活性。

作者還發現，ATG各組中CD56+細胞IFN-γ和Granzyme-B分泌量高于CD3組。分泌IFN-γ和Granzyme-B是免疫活性細胞發揮殺傷作用的重要途徑之一[10]。這一結果也提示，ATG誘導培養的CIK具有更強的免疫殺傷功能。

CD3組與ATG各組細胞增殖指數沒有差異，但ATG各組培養的CIK中CD3-CD56+的NK細胞比例增高。這可能是因為ATG的實驗劑量耗竭了部分T細胞，使得起始T細胞數量相對降低，從而導致NK細胞成為優勢增殖細胞。NK細胞治療也是臨床常用的腫瘤過繼免疫治療方法之一，是否可以利用更高劑量的ATG來耗竭培養起始細胞中的T細胞，使得NK細胞成為數量優勢細胞來進行NK細胞的培養和誘導，也是一個值得探討的課題。

綜上所述，作者認為采用ATG刺激培養的CIK活性優于經典培養方案，抗腫瘤能力較強；ATG作為被批準用于臨床治療的藥物，與抗CD3單克隆抗體相比較更安全可靠，且價格相對低廉，可作為其替代品用于CIK的培養。

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中圖分類號R730.51

#通信作者：闞全程，男，1963年9月生，博士，教授，研究方向：臨床藥理學，E-mail:kqc2008@163.com；張毅，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫學、腫瘤干細胞和生物細胞治療，E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.003

*河南省衛生廳科技攻關課題201303033