CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的真核表達載體的構建*

趙云龍，楊衛紅，閆　良，魏璐嫚，王　沛， 張　衛，曾昭書#，張莉蓉#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學教研室 鄭州 450001　2)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450001　3)鄭州大學藥學院藥理學系 鄭州 450001　4)鄭州大學第一附屬醫院麻醉科 鄭州 450052

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CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的真核表達載體的構建*

趙云龍1)，楊衛紅1)，閆良2)，魏璐嫚2)，王沛3)， 張衛4)，曾昭書1)#，張莉蓉2)#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學教研室 鄭州 4500012)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 4500013)鄭州大學藥學院藥理學系 鄭州 4500014)鄭州大學第一附屬醫院麻醉科 鄭州 450052

關鍵詞CYP3A4；真核表達載體；啟動子；內含子

摘要目的：構建CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的真核表達載體，研究CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10的啟動子功能。方法：以質粒pGEM-CYP3A4為模板擴增出CYP3A4 cDNA，PCR產物經EcoRV、XbaⅠ雙酶切后插入到pcDNA3.1/Hygro(+)的EcoRV、XbaⅠ雙酶切位點之間，構建pcDNA3.1-3A4。分別以人基因組DNA和pGEM-CYP3A4質粒DNA為模板，擴增出CYP3A4啟動子和CYP3A4內含子10全長(野生型和突變型)序列，插入到pcDNA3.1-3A4的MluⅠ、NheⅠ雙酶切位點之間，取代原有的CMV啟動子，構建pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4(野生型)和pcDNA3.1-M3A4(突變型)。將質粒轉染入HepG2細胞，檢測CYP3A4 mRNA表達水平。結果：構建的重組質粒經酶切驗證與測序鑒定，插入片段的序列和方向與預期完全一致。與轉染pcDNA3.1/Hygro(+)的HepG2細胞比較，pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4轉染組細胞CYP3A4 mRNA表達水平均提高(P<0.05)，但pcDNA3.1-M3A4組表達水平低于pcDNA3.1-P3A4和pcDNA3.1-W3A4組(P<0.05)。結論：成功構建了CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的真核表達載體；CYP3A4內含子10能夠啟動CYP3A4基因的表達，且存在CYP3A4*1G等位基因依賴性。

Construction of eukaryotic expression vector of CYP3A4 intron 10 promoter regulated by CYP3A4*1G

ZHAOYunlong1),YANGWeihong1),YANLiang2),WEILuman2),WANGPei3),ZHANGWei4),ZENGZhaoshu1),ZHANGLirong2)

1)DepartmentofForensicMedicine,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500013)DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsCYP3A4；eukaryotic expression vector；promoter；intron

AbstractAim: To construct CYP3A4 eukaryotic expression vector which promoted by CYP3A4 intron 10 regulated by CYP3A4*1G.Methods: The segment of CYP3A4 cDNA was amplified from plasmid pGEM-CYP3A4 by PCR，and the PCR product was digested withEcoRV andXbaⅠ and ligated into pcDNA3.1/Hygro(+) to obtain vector pcDNA3.1-3A4. The segment of CYP3A4 promoter and that of the full-length of CYP3A4 intron 10 with CYP3A4*1G allele were amplified from human genome DNA and pGEM-CYP3A4,respectively,then were ligated into pcDNA3.1-3A4 between the sites of restriction enzymeMluⅠ andNheⅠ replacing the CMV promoter,to obtain pcDNA-P3A4,pcDNA3.1-W3A4 and pcDNA3.1-M3A4. The vectors were transfected into HepG2, respectively,and the levels of CYP3A4 mRNA were detected by quantitative real-time PCR. Results: These insertion sequences and their directions were exactly correct. The CYP3A4 mRNA level of CYP3A4 promoter transfection group, intron 10 (GG) group, intron 10 (AA) transfection group were all higher compared with empty plasmid transfection group. The CYP3A4 mRNA level of intron 10 (AA) group was lower than those of CYP3A4 promoter group and intron 10 (GG) group (P<0.05).Conclusion: CYP3A4 eukaryotic expression vector promoted by CYP3A4 intron 10 regulated by CYP3A4*1G has been constructed successfully. CYP3A4 intron 10 could promote CYP3A4 mRNA expression, which is regulated by CYP3A4*1G allele.

CYP3A4是CYP3A亞家族中最主要的成員，占P450酶系總量的30%～40%，主要分布在肝臟和腸道。它參與了許多藥物和外源性毒物的氧化代謝，可代謝約50%的臨床常用藥物。研究[1-2]表明，人肝臟中CYP3A4的表達及其活性存在著明顯的個體差異，并且這種差異90%與遺傳多態性有關。CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4內含子10中的一個單核苷酸多態性(SNP)，其等位基因頻率在亞洲和南非人群中超過20%[3-5]。研究[5-10]表明CYP3A4*1G與阿托伐他汀、環孢霉素、他克莫司、芬太尼等藥物的劑量、療效及藥代動力學改變有關。前期體外研究[11]發現，在HepG2細胞中CYP3A4內含子10具有啟動子活性，并被CYP3A4*1G等位基因依賴性調控，但CYP3A4*1G調控的CYP3A4內含子10與CYP3A4基因表達之間的關系尚不清楚。該研究分別構建了由CYP3A4啟動子和CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的CYP3A4真核表達載體，并將其轉染入HepG2細胞，檢測CYP3A4 mRNA的表達情況。

1材料與方法

1.1材料pcDNA3.1/Hygro(+)空質粒、pGEM-CYP3A4為浙江大學藥學院藥物分析與藥物代謝研究室曾蘇教授惠贈。攜帶CYP3A4*1G(GG/AA)的基因組DNA來自河南漢族健康志愿者，由鄭州大學基礎醫學院藥理教研室保存。質粒小提試劑盒(Axygen公司)，膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，限制性內切酶(NEB公司)，T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)，PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶、感受態DH5α和反轉錄試劑；TriPure Isolation試劑(羅氏公司)；SYBR SELECT MASTER MIX(Life公司)、Invitrogen lip2000。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。儀器設備主要有超凈工作臺、PCR擴增儀、NanoDrop 2000c分光光度計、37 ℃搖床、離心機、水平電泳儀、ABI 7500Fast實時熒光定量PCR儀等。

1.2質粒擴增將pcDNA3.1/Hygro(+)空質粒、pGEM-CYP3A4質粒分別轉化到DH5α感受態細胞內，使其隨細胞的繁殖而復制擴增，然后用質粒小提試劑盒提取質粒并測定濃度備用。

1.3目的片段的擴增、純化及回收根據NCBI數據庫中CYP3A4 cDNA(NM_017460.5)設計引物，在上、下游引物的5’端分別加上EcoRV和XbaⅠ酶切位點和保護堿基。根據NCBI數據庫中CYP3A4基因(AF280107)5’端上游啟動子區序列設計引物，在上、下游引物的5’端分別加上MluⅠ和NheⅠ酶切位點和保護堿基。根據CYP3A4基因(AF280107)內含子10全長序列設計引物，在上、下游引物的5’端分別加上MluⅠ和NheⅠ酶切位點和保護堿基。PCR引物序列見表1。擴增CYP3A4 cDNA所用模板為pGEM-CYP3A4質粒DNA，擴增 CYP3A4啟動子、CYP3A4內含子10所用模板為人類基因組DNA。PCR反應體系：PrimeSTAR?Max DNA聚合酶(2×) 25 μL，上、下游引物各3 μL，模板DNA 4 μL，超純水補至50 μL。反應條件為98 ℃10 s，65 ℃15 s，72 ℃2 min，30個循環。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，按膠回收試劑盒說明書操作，回收目的片段并測濃度。

1.4pcDNA3.1-3A4重組質粒的構建用EcoRV和XbaⅠ雙酶切空質粒pcDNA3.1/Hygro(+)、PCR產物CYP3A4 cDNA片段，純化回收后測DNA濃度，16 ℃連接過夜。連接產物轉化到DH5α感受態細胞，涂在含氨芐青霉素 (100 mg/L) 的LB固體培養基上，根據培養板菌落生長情況挑取單克隆，提取質粒DNA，用BamHⅠ進行酶切驗證。陽性質粒pcDNA3.1-3A4送立菲生物技術有限公司測序。

1.5CYP3A4啟動子及CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的真核表達載體的構建用MluⅠ和NheⅠ雙酶切重組質粒pcDNA3.1-3A4、PCR產物CYP3A4啟動子及內含子10 DNA片段，純化回收測DNA濃度，16 ℃連接過夜。然后轉化、篩選、提取質粒，質粒DNA用MluⅠ和NheⅠ雙酶切驗證。陽性質粒pcDNA3.1-P3A4(CYP3A4啟動子重組質粒)、pcDNA3.1-W3A4(CYP3A4內含子10野生型重組質粒)和pcDNA3.1-M3A4(CYP3A4內含子10突變型重組質粒)送立菲生物技術有限公司測序,測序結果用DNAMAN軟件與預期序列比對。載體構建示意圖見圖1。

表1　擴增目的片段所用引物

F表示上游引物，R表示下游引物，下劃線表示酶切位點。

圖1　載體構建流程

1.6重組質粒轉染細胞中CYP3A4 mRNA的檢測

將按1.5方法構建的3種質粒及空質粒pcDNA3.1/Hygro(+)分別轉染入HepG2細胞，48 h后收集細胞，采用實時熒光定量PCR檢測CYP3A4 mRNA的表達水平。以GAPDH為內參，用ΔΔCT法計算CYP3A4 mRNA表達水平。

1.7統計學處理應用SPSS 21.0對數據進行分析，4組間CYP3A4 mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1構建的重組質粒的鑒定重組質粒pcDNA3.1-3A4的BamHⅠ酶切結果見圖2，目的條帶介于500 bp與750 bp之間。重組質粒pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4的MluⅠ和NheⅠ雙酶切結果見圖3，目的條帶介于1 000 bp與2 000 bp之間。酶切結果均與預期片段長度相符。測序結果顯示均正確。

M：marker;1～3：pcDNA3.1-3A4。圖2　pcDNA3.1-3A4酶切結果

M：marker;1：pcDNA3.1-P3A4;2：pcDNA3.1-W3A4;3：pcDNA3.1-M3A4。圖3　pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4的雙酶切結果

2.2轉染細胞中CYP3A4 mRNA表達水平的比較

4種重組質粒轉染的HepG2細胞中CYP3A4 mRNA表達水平測定結果見表2。

表2　4組細胞中CYP3A4 mRNA表達水平

4組比較，F=15.218，P=0.001；*：與pcDNA3.1/Hygro(+)組相比，P<0.05；#：與pcDNA3.1-P3A4和pcDNA3.1-W3A4組相比，P<0.05。

3討論

啟動子一般位于基因的上游，能夠與RNA聚合酶特異性結合從而啟動轉錄。研究[12]發現，一個基因的表達可以同時受多個啟動子調控，且不同的啟動子轉錄效率不同。有研究[13-14]報道一些內含子具有啟動子活性，可調控基因的表達。該課題組前期通過雙熒光素酶報告基因研究發現，與藥物代謝密切相關的CYP3A4基因，除了5’端啟動子外，其內含子10也具有啟動子功能，并具有CYP3A4*1G等位基因依賴性[11]。基因的表達往往受多方面因素的影響，構建cDNA重組質粒并用于細胞轉染可以排除其他調控序列對目的基因表達的干擾，從而有效地驗證某一DNA片段或SNP對目的基因表達的影響。有文獻[15]報道將內含子嵌入真核表達載體，可通過測定外源基因的表達研究其功能。為驗證CYP3A4內含子10是否對CYP3A4基因表達有影響，該研究構建了一系列真核表達載體。

重組質粒中的目的片段是否正確連入載體，需要經過測序驗證。在測序之前往往先進行菌液PCR或酶切初步驗證。菌液PCR在初篩過程中比較方便而且更為經濟，但可能存在非特異性擴增，導致假陽性，不如酶切結果可靠。該研究采用酶切驗證。值得注意的是，由于pcDNA3.1-3A4重組質粒構建完成后，XbaⅠ酶切位點前方5’端插入了兩個堿基GA，形成了GATC序列，該序列能夠被Dam甲基化酶識別，在腺嘌呤N6位置引入甲基，從而導致酶切受阻形成假陰性。為此，實驗中進行BamHⅠ單酶切驗證。由于pcDNA3.1/Hygro(+)空質粒與CYP3A4 cDNA各有一個BamHⅠ酶切位點，CYP3A4 cDNA插入EcoRV-XbaⅠ處后，二者相距686 bp，用BamHⅠ酶切后電泳圖上顯示酶切結果介于500 bp與750 bp之間者為陽性。

細胞轉染實驗結果表明，CYP3A4內含子10能夠有效地啟動CYP3A4基因的表達，并存在CYP3A4*1G等位基因依賴性，CYP3A4*1G突變型(AA)啟動子活性低于野生型(GG)。

總之，該研究成功構建了由CYP3A4啟動子及CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內含子10啟動的CYP3A4真核表達載體，并從細胞水平進一步證實了CYP3A4*1G依賴的內含子10可啟動CYP3A4 mRNA的表達，為CYP3A4內含子10及CYP3A4*1G的功能與機制研究奠定了基礎，為從內含子基因調控角度闡明CYP3A4酶活性的個體差異提供了新的理論依據。

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中圖分類號R394.6;Q756

#通信作者：張莉蓉，女，1964年10月生，博士，教授，博士研究生導師，研究方向：藥物基因組學，E-mail:zhanglirongzzu@126.com；曾昭書，男，1973年5月生，博士，教授，碩士研究生導師，研究方向：法醫遺傳學，E-mail:zzs@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.004

*國家自然科學基金項目81173127,81171060；河南省杰出青年基金項目074100510020；河南省教育廳基礎研究項目13A310663；河南省

科技廳基礎與前沿技術研究計劃項目142300410206