N-乙酰-D-乳糖胺、抗CD28單克隆抗體對肺癌患者來源的CIK細胞增殖及殺傷功能的影響*

石曉娟，喬永濤，楊　黎，楊雙寧，黃建敏，趙　璇，李　紅，張　毅

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 450052　3)鄭州市第七人民醫院臨床營養科 鄭州 450000　4)河南省腫瘤免疫治療工程技術研究中心 鄭州 450052

?

N-乙酰-D-乳糖胺、抗CD28單克隆抗體對肺癌患者來源的CIK細胞增殖及殺傷功能的影響*

石曉娟1,2)，喬永濤3)，楊黎1)，楊雙寧1)，黃建敏1)，趙璇1)，李紅1)，張毅1,2,4)#

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 4500522)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤科 鄭州 4500523)鄭州市第七人民醫院臨床營養科 鄭州 4500004)河南省腫瘤免疫治療工程技術研究中心 鄭州 450052

關鍵詞N-乙酰-D-乳糖胺；CIK細胞；抗CD28單克隆抗體；細胞增殖；殺傷功能；肺腫瘤

摘要目的：觀察N-乙酰-D-乳糖胺聯合抗CD28單克隆抗體對細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)增殖及殺傷功能的影響。方法：提取32例肺癌患者的外周血單個核細胞，分為對照組、抗CD28單克隆抗體組、N-乙酰-D-乳糖胺組及抗CD28單克隆抗體和N-乙酰-D-乳糖胺聯合組(聯合組)，依據CIK細胞培養流程培養和分組處理后于第4、8、10、12、14天測定各組細胞增殖，第14天測定IL-2、IL-10、γ干擾素及腫瘤壞死因子-α的分泌及對K562細胞的殺傷作用。結果：抗CD28單克隆抗體、N-乙酰-D-乳糖胺單獨作用均能促進CIK細胞增殖及IL-2及腫瘤壞死因子-α的分泌，增加效應細胞(CD3+CD8+細胞)的比例，增強CIK細胞對K562細胞的殺傷能力(P<0.05)，但二者聯合沒有協同效應(P>0.05)。結論：N-乙酰-D-乳糖胺與抗CD28單克隆抗體均能增強CIK細胞增殖及殺傷功能，但二者無協同作用。

Effects of LacNAc and anti-CD28 mAb combination on proliferation and killing function of cytokine-induced killer cells from patients with lung cancer

SHIXiaojuan1,2)，QIAOYongtao3)，YANGLi1)，YANGShuangning1)，HUANGJianmin1)，ZHAOXuan1)，LIHong1)，ZHANGYi1,2,4)

1)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)DepartmentofClinicalNutrition,ZhengzhouNO.7People'sHospital,Zhengzhou4500004)EngineeringandTechnologyResearchCenterforTumorImmunotherapyofHenanProvince，Zhengzhou450052

Key wordsLacNAc;CIK cell;anti-CD28 mAb;cell proliferation;killing function;lung neoplasm

AbstractAim: To study the influence of LacNAc with or without anti-CD28 mAb on the proliferation and function of CIK cells from patients with lung cancer.Methods: The peripheral blood was collected from 32 patients with lung cancer.The monocytes were extracted and divided into four groups after suspension, control group,anti-CD28 mAb group,LacNAc group,and anti-CD28 mAb combined with LacNAc group(combined group),then cultured as CIK technological process and treated accordingly. The ability of proliferation was measured on the day of 4th, 8th, 10th, 12th, and 14th.IFN-γ,TNF-α,IL-2 and IL-10 secreted by CIK cells were measured on the 14th day. Phenotypic analysis via flow cytometry and anti-tumor affection on K562 cells via CCK-8 assay were performed on the 14th day.Results: The proliferation of CIK cells was significantly enhanced by LacNAc or anti-CD28 mAb. The cytokine secretion，ratio of effector cells(CD3+CD8+cells) and killing efficiency of CIK cells all improved after being treated by LacNAc or anti-CD28 mAb(P<0.05),but there was no interaction between LacNAc and anti-CD28 mAb(P>0.05).Conclusion: It is indicated that CIK cells treated with LacNAc or anti-CD28 mAb exhibit a potential in cytotoxic activity against tumor cells, but there is no interaction between them.

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells，以下簡稱CIK細胞)是一群具有多種細胞分型的免疫細胞，具有增殖能力高、細胞毒性強等優點，在腫瘤的生物治療中具有極大的應用價值[1]。CIK細胞由源于外周血的單個核細胞經多種細胞因子如IL-2、IFN-γ等刺激而獲得[2-3]。目前對CIK細胞臨床療效的研究[4-5]初步顯示其對肺癌、乳腺癌、食管癌、腎癌等多種惡性腫瘤均有良好的療效。N-乙酰-D-乳糖胺(N-Acetyl-D-lactosamine，LacNAc)具有半乳糖殘基，與Galectin-3結合后能夠激活細胞內部的相關信號通路，刺激細胞的擴增及功能的增強[6]。CD28作為細胞表面活化的第二信號分子，可促進T細胞的活化，但其對CIK細胞的作用仍不十分清楚。作者觀察了LacNAc及抗CD28單克隆抗體(抗CD28 mAb)對CIK細胞增殖及靶細胞殺傷功能的影響，探討二者在CIK細胞培養中的作用，為腫瘤的生物治療提供理論依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器酶標儀(美國Sigma公司)，FACS流式分析儀(美國BD公司)，恒溫培養箱，臺式離心機，超凈工作臺，高壓消毒鍋，倒置顯微鏡。LacNAc、抗CD28 mAb、二甲基亞砜、IFN-γ、抗CD3單克隆抗體、人重組白細胞介素-2(IL-2)均購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)，PE-CY7-CD3、percp-CD4、APC-CY7-CD8均購自美國BD公司，小牛血清(天津市正江高科技公司)，人淋巴細胞分離液(上海四季青公司)，IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10 ELISA試劑盒均購自美國Biolegend公司，Cell Counting Kit-8試劑(CCK-8)(碧云天生物技術研究所)；白血病K562細胞購自美國細胞庫。

1.2標本來源選取2012年8月至2013年9月于鄭州大學第一附屬醫院就診、經病理確診為肺癌的患者32例，其中男18例，女14例，年齡39～72(53.8±9.4)歲。在患者知情同意并且不影響病情及治療的情況下采集外周血10 mL。該研究經醫院倫理委員會批準。

1.3K562細胞的培養于含體積分數10%小牛血清的RPMI 1640培養基，37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內培養。

1.4CIK細胞的培養與分組使用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，加入含體積分數10%小牛血清的RPMI 1640培養基，在37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中孵育2 h，收集未貼壁細胞，分為4組，分別是對照組、抗CD28 mAb組、LacNAc組和LacNAc聯合抗CD28 mAb組(聯合組)。細胞培養第1天加1 000 U/mL IFN-γ，第2天加1 000 U/mL IL-2及抗CD3單克隆抗體(25 μg/L)。同時根據以上分組，在細胞培養第1天添加LacNAc(10 μg/L)或抗CD28 mAb(1 μg/L)。37 ℃、體積分數5%CO2培養箱培養至第14天，每3 d半量換液1次，按1 000 U/mL添加IL-2，同時相應添加LacNAc(10 μg/L)和抗CD28 mAb(1 μg/L)。

1.5CIK細胞體外增殖能力的檢測在顯微鏡下觀察各組CIK細胞的生長狀況。分別于第4、8、10、12、14天取均勻分布的細胞懸液，在200倍鏡下計數細胞，并以第1天細胞數為參照計算細胞增殖倍數。

1.6CIK細胞分泌細胞因子的能力檢測以上各組在培養至第12天時取CIK細胞，生理鹽水洗2次，離心后加不含細胞因子的培養基重懸，培養48 h后離心取上清，使用ELISA試劑盒檢測CIK細胞分泌IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-2的能力。

1.7CIK細胞免疫表型分析取以上各組誘導培養第14天的CIK細胞，離心洗滌后加入免疫熒光抗體或相應的同型抗體(PE-CY7-CD3，percp-CD4，APC-CY7-CD8)進行染色，混勻后4 ℃避光孵育15 min，流式細胞術檢測CIK細胞免疫表型。

1.9統計學處理應用SPSS 18.0處理數據。采用析因設計的方差分析觀察抗CD28 mAb、LacNAc單用及聯合對CIK細胞體外增殖能力，分泌IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-2的能力，細胞免疫表型及對K562細胞殺傷活性的影響，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1各組CIK細胞處理不同時間的增殖倍數比較

結果見表1。外周血單個核細胞在加入IFN-γ、IL-2以及抗CD3單克隆抗體刺激后，細胞體積增大，胞質變豐富，細胞核增大。從第4天細胞開始聚集并成簇狀生長，且細胞增殖明顯加快。由表1可知，與對照組相比，抗CD28 mAb組從第8天細胞增殖增強，而LacNAc組從第12天細胞增殖增強，但二者聯用對細胞增殖無協同作用。

表1　各組CIK細胞處理不同時間的增殖倍數比較(n=32)

2.2各組CIK細胞分泌細胞因子的能力比較結果見表2。由表2可知，抗CD28 mAb對CIK細胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2 有促進作用，對IL-10無作用，LacNAc對TNF-α和IL-2有促進作用，對IFN-γ和IL-10無作用，但二者無協同作用。

表2　各組CIK細胞

2.3各組CIK細胞免疫表型比較9例患者獲流式細胞術的結果，見表3。由表3可知，抗CD28 mAb、LacNAc單用增高了CD3+CD8+細胞比例，降低了CD3+CD4+細胞比例，但二者無協同作用。

表3　各組CIK細胞的細胞表型所占比例(n=9)　%

2.4各組CIK細胞對K562細胞的殺傷能力抗CD28 mAb和LacNAc對CIK細胞的殺傷活性均有增強作用，但二者無協同作用,見表4。

表4　各組CIK細胞對K562細胞的殺傷效能比較(n=32)

F抗CD28 mAb=173.075，P<0.001；FLacNAc=13.719，P<0.001；F交互=1.430，P=0.234。

3討論

CIK細胞是目前用于過繼免疫治療最多的效應細胞[7]，其增殖及功能受多種因素影響[8]。該研究結果顯示LacNAc、抗CD28 mAb均可促進CIK細胞的增殖，但二者無協同效應。研究[9]顯示，抗CD28 mAb與CD28結合可提供細胞表面活化的第二信號，從而促進T細胞增殖。根據文獻[10]報道，CTL表面的Galectin-3可限制TCR與CD8的共區域化，從而限制T細胞的激活，而富含半乳糖殘基的LacNAc能與Galectin-3結合，釋放TCR與CD8共區域化，使T細胞對激活信號更加敏感，進而增強T細胞的增殖能力和殺傷能力。

通過檢測細胞因子的分泌量可鑒定CIK細胞的功能[11]，而這些細胞因子可以與CIK細胞聯合發揮抗腫瘤作用[12]。一些研究[13-15]結果表明抗CD28 mAb對CIK細胞分泌細胞因子均有促進作用，同時抗CD28 mAb與LacNAc具有一定的協同作用。該研究發現LacNAc、抗CD28 mAb促進了CIK細胞分泌TNF-α、 IFN-γ等細胞因子，但二者并無協同作用。CIK細胞分泌的細胞因子可以直接發揮抗腫瘤作用并提高CIK細胞對腫瘤細胞的敏感性，增加CIK對腫瘤細胞的識別和殺傷。

通過使用流式細胞分析儀對所培養細胞的表型進行分析，結果顯示LacNAc及抗CD28 mAb均可以提高CD3+CD8+細胞比例，減少CD3+CD4+細胞比例。說明一定量的LacNAc和抗CD28 mAb可能會選擇性地增強功能性CIK細胞的擴增，同時又不促進免疫抑制性細胞的擴增。這一結果為通過體外擴增腫瘤患者CIK細胞，獲得較好質量的細胞，提高其抗腫瘤免疫功能，提供了一定的免疫學依據。

此外，該實驗結果表明LacNAc、抗CD28 mAb可提高CIK細胞對靶細胞的殺傷活性，但二者無協同作用。已有研究[16]顯示CIK細胞在體外培養后，CD4+細胞比例降低而CD8+細胞比例升高，提示獲得的CIK細胞含有更多比例的效應細胞。因此該實驗中CIK細胞對靶細胞的高殺傷效應可能與效應細胞比例提高有關。

綜上所述，該研究證實了LacNAc、抗CD28 mAb可以提高CIK細胞的增殖能力、提高其分泌細胞因子的能力、促進功能性CIK細胞的增殖并增強CIK細胞對靶細胞的殺傷功能，但是二者并無協同作用，還需要進一步驗證或從信號通路等方面探討其機制。

參考文獻

[1]ROSENBERG SA,SPIESS P,LAFRENIERE R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes[J].Science,1986,233(4770):1318

[2]GERMENIS AE, KARANIKAS V. Cord blood as a source of non-senescent lymphocytes for tumor immunotherapy[J]. J Reprod Immunol,2010,85(1):47

[3]INTRONA M,BORLERI G,CONTI E,et al.Repeated infusions of donor-derived cytokine-induced killer cells in patients relapsing after allogeneic stem cell transplantation: a phase Ⅰ study[J].Haematologica,2007,92(7):952

[4]SCHMIDT-WOLF IG,NEGRIN RS,KIEM HP,et al.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1):139

[5]KIM JS,CHUNG IS,LIM SH,et al.Preclinical and clinical studies on cytokine-induced killer cells for the treatment of renal cell carcinoma[J].Arch Pharm Res,2014,37(5):559

[6]DEMOTTE N,STROOBANT V,COURTOY PJ,et al.Restoring the association of the T cell receptor with CD8 reverses anergy in human tumor-infiltrating lymphocytes[J].Immunity,2008,28(3):414

[7]FAGERLI UM,ULLRICH K,STüHMER T,et al.Serum/glucocorticoid-regulated kinase 1(SGK1) is a prominent target gene of the transcriptional response to cytokines in multiple myeloma and supports the growth of myeloma cells[J].Oncogene,2011,30(28):3198

[8]MARIN V,KAKUDA H,DANDER E,et al.Enhancement of the anti-leukemic activity of cytokine induced killer cells with an anti-CD19 chimeric receptor delivering a 4-1BB-zeta activating signal[J].Exp Hematol,2007,35(9):1388

[9]VASIR B,WU Z,CRAWFORD K,et al.Fusions of dendritic cells with breast carcinoma stimulate the expansion of regulatory T cells while concomitant exposure to IL-12, CpG oligodeoxynucleotides, and anti-CD3/CD28 promotes the expansion of activated tumor reactive cells[J].J Immunol,2008,181(1):808

[10]王菲,王麗萍,張震,等.凍存對細胞因子誘導的殺傷細胞免疫表型及細胞內因子表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(1):11

[12]李靜,王菲,劉艷芬,等.不同刺激物對細胞因子誘導的殺傷細胞分泌細胞因子的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2014,49(2):166

[15]徐利強,李建華,倪修文,等.細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)培養方案的優化[J].中國輸血雜志,2015,28(8):1030

中圖分類號R459.9

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向：腫瘤免疫學、腫瘤干細胞和生物細胞治療，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.008

*國家自然科學基金面上項目81370487