氟病區成人雌激素受體α基因PvuⅡ多態性與骨組織異常的關系*

段雷振，楊躍進，周　桐，崔留欣，丁　中，李世宏，程學敏，趙明旭，周郭育，巴　月#

1)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 450001　2)開封市疾病預防控制中心地方病科 開封 475000

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氟病區成人雌激素受體α基因PvuⅡ多態性與骨組織異常的關系*

段雷振1)，楊躍進2)，周桐1)，崔留欣1)，丁中2)，李世宏2)，程學敏1)，趙明旭1)，周郭育1)，巴月1)#

1)鄭州大學公共衛生學院環境衛生學教研室 鄭州 4500012)開封市疾病預防控制中心地方病科 開封 475000

關鍵詞氟；雌激素受體；基因多態性；骨組織

摘要目的：探討雌激素受體(ER)α基因PvuⅡ多態性與氟暴露地區成人骨組織異常的關系。方法：采用整群抽樣方法，在氟病區及對照區選擇當地出生或居住5 a以上18～55歲的人群為觀察對象；采用PCR-RFLP法分析ERα基因PvuⅡ多態性；采用X線檢查兩區人群骨組織改變。結果：暴露組和對照組人群骨組織異常率分別為65.34%和40.32%，差異有統計學意義(P<0.05)；以pp基因型為參照，暴露組攜帶Pp/PP人群骨組織異常的危險性增高(PR=1.087, 95%CI=1.053～1.437或PR=1.145, 95%CI=1.104～1.318)。結論：攜帶ERα PvuⅡPp/PP基因型可能增加骨組織對氟暴露敏感性。

ERα gene PvuⅡpolymorphism and bone tissue abnormalities in adults exposed to fluoride

DUANLeizhen1),YANGYuejin2),ZHOUTong1),CUILiuxin1),DINGZhong2),LIShihong2),CHENGXuemin1),ZHAOMingxu1),ZHOUGuoyu1),BAYue1)

1)DepartmentofEnvironmentalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofEndemicDisease,KaifengCenterforDiseasePreventionandControl,Kaifeng475000

Key wordsfluoride;estrogen receptor;gene polymorphism;bone tissue

AbstractAim: To explore the relationship between estrogen receptor α(ERα) gene polymorphism and bone tissue abnormalities in adults exposed to fluoride in drinking water.Methods: Adults aged from 18 to 55 years old who were born and grew or lived there for at least 5 years in endemic fluorosis villages or control villages were recruited using cluster sampling. They were allocated into endemic fluorosis group and control group in accordance with the above areas. PCR-RFLP was used to determine PvuⅡ genotype in ERα gene. X-ray was used to detect changes of the subjects′ bone tissue of the two groups.Results: The abnormal rate of bone tissue in endemic fluorosis group(65.34%) were significantly higher than that in control group(40.32%)(P<0.05). The increased risk of bone tissue abnormalities was observed in subjects carrying Pp/PP genotype of ERα gene compared with subjects carrying pp genotype from endemic fluorosis group(PR=1.087,95%CI=1.053-1.437;PR=1.145,95%CI=1.104-1.318).Conclusion: Bone tissue in people who carried ERα PvuⅡ Pp/PP genotype may be more susceptible to fluoride exposure.

氟斑牙和氟骨癥是地方性氟中毒的特征性臨床表現。骨密度受遺傳因素和環境因素的共同影響[1-2]。研究[3]發現，雌激素受體(estrogen receptor,ER)基因突變可導致骨密度明顯下降，過量氟攝入亦可造成骨質疏松、骨質硬化等骨相損傷。但目前為止，有關氟暴露與ERα基因多態性交互作用對骨組織改變的影響尚未闡明。該研究通過現況調查，應用X線檢查暴露組人群骨組織變化，并運用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)檢測ERα基因PvuⅡ多態性，以探討氟暴露人群ERα基因PvuⅡ多態性與骨組織異常之間的關系。

1對象與方法

1.1調查點及調查對象的選擇

1.1.1調查點的選擇在準確監測水氟含量的基礎上，選擇河南省某縣的5個村莊作為調查點，根據水氟濃度將5個村分為高氟區(水氟濃度2.44±1.88 mg/L)和對照區(水氟濃度0.37±0.15 mg/L)。除水氟濃度外，調查地區經濟水平、自然條件、農作物種類、生活習慣、人口構成等均一致，且均無工業氟污染，調查區內其他環境介質氟水平差異無統計學意義[4]。

1.1.2調查對象的選擇選取調查地區出生成長或居住5 a以上的18～55歲成人為調查對象。排除有骨代謝疾病和3個月內服用任何影響骨代謝藥物者，包括甲狀腺和甲狀旁腺功能改變、Cushing綜合征、慢性肝腎疾病和骨關節病者等，以及服用雌激素、降鈣素、鈣制劑及甲狀腺激素者等。在滿足上述條件人群中選擇238例，其中對照區62人為對照組，高氟區176人為暴露組，對其進行健康體檢、骨骼X線檢查并抽取空腹外周靜脈血。

1.2生物樣本的采集研究對象于調查前日晚10點禁食，次日晨起抽取空腹外周靜脈血10 mL(抗凝及非抗凝各5 mL)于-80 ℃低溫保存，用于基因組DNA提取和ERα PvuⅡ多態性分析。

1.3骨組織異常情況檢查及結果判定依照中國地方病防治辦公室頒布的地方性氟中毒X線診斷標準，分別對前臂(包括肘關節及腕關節)、小腿(包括膝關節)及骨盆拍正位片，重點觀察骨質、骨周和關節結構的改變。X線檢查結果由影像專業醫師判定，骨組織異常主要包括骨質疏松、骨質硬化、骨周軟組織硬化、骨結構改變等。

1.4ERα PvuⅡ基因分型

1.4.1全血基因組DNA提取采用全血基因組抽提試劑盒(Axygen Biosciences,美國)提取基因組DNA。

1.4.2ERα PvuⅡ多態性分析參照相關文獻[5]設計PCR擴增引物，并由上海博尚生物公司合成。上游引物：5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTC CTATTCTCC-3’，下游引物：5’-TCTTTCTCTGCCAC CCTGGCGTCGATTATCTGA-3’，產物大小1 300 bp。PCR體系為25 μL，其中基因組DNA 100 ng、2×Taq Master Mix 12.5 μL(康為世紀，北京)、ddH2O 6.5 μL、上和下游引物濃度為250 nmol/L。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s、60 ℃退火30 s、72 ℃ 30 s延伸，共 35個循環；72 ℃末端延伸5 min。PCR-RFLP反應體系為30 μL，其中PCR產物10.0 μL、PvuⅡ內切酶1.0 μL(MBI Fermentas，立陶宛)、10×Buffer Tango 2 μL、ddH2O 17 μL，37 ℃酶切4 h。PCR產物經PvuⅡ酶切后，置15 g/L瓊脂糖電泳，紫外燈下，存在PvuⅡ酶切位點的純合子(pp)顯示800 bp和500 bp兩條帶；缺乏PvuⅡ酶切位點的純合子(PP)顯示1 300 bp一條帶；雜合子(Pp)顯示上述三條帶。

1.5統計學處理采用EpiData 2.0建立數據庫，以雙人雙機獨立錄入方式對問卷數據及測定結果錄入。數據分析采用SPSS 12.0。基因多態性分析以Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗確定對照組遺傳平衡狀況。ERα PvuⅡ各基因型在不同性別人群中的分布分析采用χ2檢驗。兩組人群骨組織異常率、ERα PvuⅡ不同基因型人群骨組織異常率比較采用log-binomial。采用logistic回歸分析氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態性交互作用對骨組織改變的影響。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1兩組人群基本情況比較結果見表1。2組人群年齡分布、吸煙及飲酒狀況差異均無統計學意義。無論男性和女性，暴露組人群尿氟水平均高于對照組，差異有統計學意義，對照組人群ERα PvuⅡ基因型分布符合遺傳平衡(χ2=1.196,P=0.274)。

表1　兩組人群基本情況比較

2.2兩組人群骨組織異常情況比較結果見表2，暴露組骨組織異常率明顯高于對照組，其差異有統計學意義，校正年齡及性別因素后，暴露組人群骨組織異常的危險性增加。

表2　兩組人群骨組織異常情況比較

*：以年齡、性別為校正因素。

2.3ERα PvuⅡ基因多態性與骨組織異常關系

2.3.1兩組人群ERα PvuⅡ3種基因型的分布結果見表3。ERα PvuⅡ基因型在兩組不同性別人群中分布的差異無統計學意義。

表3　兩組不同性別

2.3.2攜帶ERα PvuⅡ不同基因型人群骨組織異常率比較見表4。由表4可知，校正年齡、性別及尿氟濃度后，暴露組攜帶Pp及PP基因型個體骨組織異常率明顯高于攜帶pp基因型個體。

2.3.3氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態性交互作用對骨組織的影響見表5。校正年齡、性別及尿氟水平后，氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態性不存在交互作用。

表4　攜帶ERα PvuⅡ不同基因型人群骨組織異常率比較

*:以年齡、性別及尿氟濃度為校正因素。

表5　 氟暴露與ERα基因

*：以年齡、性別及尿氟為校正因素。

3討論

3.1氟暴露對人群骨組織的影響該研究結果顯示，暴露組人群骨組織異常率明顯高于對照組人群，在校正了年齡及性別因素后，暴露組人群骨組織異常的危險性較對照組增加，提示即使在水氟濃度較低的輕病區，長期暴露亦可導致骨質疏松、骨質硬化、骨周軟組織硬化、骨結構改變等骨組織異常率增加，與以往研究結果一致[6]。

3.2ERα PvuⅡ基因多態性與骨組織異常關系該研究選擇漢族成年人群[7]為研究對象，結果顯示ERα PvuⅡ基因型在不同地區、不同性別人群中的分布一致。在調整年齡、性別及尿氟濃度后，以pp基因型為參照，在氟暴露情況下攜帶Pp和PP基因型骨組織異常的危險性分別增加了9%和15%，提示攜帶Pp/PP基因型個體比攜帶pp基因型個體對氟暴露更為敏感，可能更容易發生骨質疏松、骨質硬化等骨組織異常改變。以往有關ERα基因PvuⅡ多態性對女性骨密度的影響研究結果不盡一致；Jeedigunta等[8]研究表明，攜帶pp基因型個體的骨密度明顯較PP基因型低；而Kobayashi等[9]研究表明，攜帶pp基因型女性骨密度較攜帶Pp或PP基因型女性骨密度高。鑒于機體對環境暴露的易感性不同，該研究就氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態性交互作用對骨組織異常的影響進行了分析。未觀察到氟暴露與ERα基因PvuⅡ多態性存在交互作用。由于機體骨代謝受多種因素影響。因此，從基因水平探索氟暴露與骨組織異常的關系，應進一步擴大樣本量，從多基因、多因素的角度深入研究。

致謝：感謝參與課題現場調查工作的鄭州大學公共衛生學院、開封市疾病預防控制中心及通許縣疾病預防控制中心地方病科的工作人員；感謝所有參與此項研究的調查對象。

參考文獻

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中圖分類號R599

#通信作者，女，1963年7月生，博士，教授，研究方向：環境相關疾病分子發病機制，E-mail:byyue@zzu.edu.cn

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.010

*國家自然科學基金資助項目81072247；河南省教育廳科學技術研究重點項目13A330653