人胰淀素和煙堿誘導相同離子通道的激活*

李秀鳳，李宗明

1)漯河醫學高等專科學校第三附屬醫院 漯河 462002　2)漯河醫學高等專科學校神經生物學實驗室 漯河 462002

?

人胰淀素和煙堿誘導相同離子通道的激活*

李秀鳳1)，李宗明2)#

1)漯河醫學高等專科學校第三附屬醫院 漯河 4620022)漯河醫學高等專科學校神經生物學實驗室 漯河 462002

關鍵詞人胰淀素受體；煙堿乙酰膽堿受體；通道激活；阿爾茨海默病；大鼠

摘要目的：觀察人胰淀素和煙堿對大鼠腦乙酰膽堿能神經元膜上受體通道活動的影響。方法：在急性分離的大鼠基底前腦神經元上，采用細胞貼附式和全細胞膜片鉗技術進行檢測。結果：人胰淀素或煙堿單獨應用可以分別誘導相同通道的激活。煙堿與人胰淀素誘導的37 pS電導單通道電流幅度分別為(-3.6±0.4)和(-3.5±0.3) pA，65 pS電導單通道電流幅度分別為(-6.0±0.2)和(-6.1±0.3) pA,兩電導水平的單通道電流比較，差異均無統計學意義(P均>0.05)。在電流鉗記錄模式，人胰淀素或煙堿單獨應用可引起神經元膜電位去極化并誘發動作電位的產生。DHβE完全阻斷煙堿和人胰淀素的作用，應用人胰淀素受體拮抗劑AC253也觀察到類似的效果。結論：人胰淀素受體和煙堿受體在中樞神經元存在功能性協同作用。

Same ion channel activation induced by human amylin and nicotine

LIXiufeng1)，LIZongming2)

1)TheThirdAffiliatedHospital,LuoheMedicalCollege,Luohe4620022)NeurobiologyLaboratory,LuoheMedicalCollege,Luohe462002

Key wordshuman amylin receptor;nicotinic acetylcholine receptor;channel activation;Alzheimer′s disease；rat

AbstractAim: To observe the channel activities of two receptors excited by human amylin and nicotine on rat brain acetylcholine neurons.Methods: The single channel cell-attached recordings and whole cell patch-clamp recordings were performed on acutely dissociated neurons of rat basal forebrain nucleus.Results: Either human amylin or nicotine individually caused the activation of the same channel. The smaller conductance(37 pS) single-channel current amplitudes induced by nicotine and amylin were (-3.6±0.4) and (-3.5±0.3) pA, respectively;the large conductance (65 pS) single-channel current amplitudes induced by them were (-6.0±0.2) and (-6.1±0.3) pA, respectively (P>0.05). Nicotine and amylin evoked the membrane depolarization and repeating action potential of neurons under current-clamp recording conditions. DHβE blocked the effects of nicotine and amylin. The similar effect was observed by using AC253.Conclusion: Human amylin and nicotine receptors functionally cooperate in the central neurons.

中樞神經系統的神經元之間的功能聯系，是通過突觸釋放神經遞質傳遞信息發生作用。由乙酰膽堿神經遞質介導的效應，主要是通過煙堿乙酰膽堿受體發揮作用。煙堿乙酰膽堿受體在學習和記憶功能、神經元發育及一些神經退行性疾病方面起著重要的作用。研究[1]表明，老年癡呆癥的一個重要病理特征是基底前腦膽堿能神經元的丟失，雖然這種選擇性的膽堿能神經元丟失的確切機制尚未完全清楚，但一種可能的原因是胰腺B細胞產生的人胰淀素分泌減少，導致神經細胞興奮性降低，最終導致膽堿能神經元死亡。在該研究中，作者采用膜片鉗技術在急性分離的大鼠基底前腦神經元上觀察人胰淀素和煙堿對細胞膜受體通道激活的影響，現將結果報道如下。

1材料與方法

1.2單個神經元的分離制備SD大鼠麻醉后，迅速斷頭取出腦組織，切取含基底前腦區的腦組織塊，放入冰冷的人工腦脊液中。將腦組織塊粘貼于載物臺上，用切片機切成300 μm厚腦組織切片，腦組織切片包含了基底前腦區域。腦組織切片用胰蛋白酶處理25 min后(溫度控制在30 ℃),用人工腦脊液洗3次, 然后用Pasteur吸管吹打分離出完整的神經元，分離出的單個神經元有明顯的突起，細胞體飽滿，立體感強，存活6 h以上。將分散的單個細胞接種于多聚L-賴氨酸涂層蓋玻片上，放在倒置顯微鏡下觀察和進行電生理記錄。在整個操作過程中，細胞處于連續供氧狀態。

1.3單通道電流和全細胞膜片鉗記錄單通道和全細胞膜片鉗記錄在室溫(20～22 ℃)下進行，實驗數據用Axopatch-700B放大器和Digidata1440A數據采集系統采集。記錄電極用1.5 mm直徑的薄壁玻璃經微電極拉制儀拉成，其電極阻抗為3～6 ΩM， 調整單通道記錄電極內液pH值至7.2。10 nmol/L人胰淀素或10 nmol/L煙堿被加入電極管液中。全細胞電流鉗模式電極管內液含K-methylsulfate 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，MgCl25 mmol/L,CaCl21 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,Na2-ATP 2.2 mmol/L，Na-GTP 0.3 mmol/L(pH值7.2)。單通道電流記錄和全細胞記錄采用低通濾波2 kHz，高通濾波10 kHz。對通道電流幅度、通道開放時間和關閉時間等進行記錄，單通道電流的幅度、通道開放概率(Po)的估算采用Fetchan程序和Clampfit軟件，只有振幅超過設定50%閾值的通道開放事件才被接受進行分析。全細胞記錄包括電流鉗和電壓鉗模式，應用橋式平衡或電容補償確保記錄信號的精確。當全細胞電壓鉗模式建立后，等待5 min使細胞穩定后，開始電壓鉗記錄或者切換到電流鉗記錄模式。記錄所獲數據儲存于計算機，然后用pCLAMP 10.0進行分析。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。煙堿組與人胰淀素組單通道電流幅度和Po的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；DHβE阻斷人胰淀素誘發的內向電流和AC253 阻斷煙堿誘發的內向電流的比較采用配對t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1煙堿或人胰淀素誘發的單通道電流結果見表1、2。

表1　煙堿或人胰淀素誘導出對應于

2.2全細胞記錄結果見表3。

3討論

Aβ神經毒性是通過人胰淀素受體[2]起作用的，但確切的機制尚不清楚。該研究結果表明，煙堿和人胰淀素誘導的通道活動是相同的，并且膽堿受體拮抗劑DHβE可以阻斷人胰淀素誘導的通道活動，同樣，煙堿作用也可以被人胰淀素受體拮抗劑AC253阻斷。這些說明胰淀素受體和煙堿乙酰膽堿受體在神經元細胞膜上存在著偶聯作用[3]。有研究[4]顯示Aβ通過作用于神經元膜上的人胰淀素受體，來影響在中樞神經系統內廣泛表達的膽堿能受體，下調煙堿乙酰膽堿受體，加快神經退行性病變，導致早期階段認知障礙。另外，有報道[5]顯示在轉基因AD小鼠中，STAT3陽性表達率最高的部位是基底前腦，其次是海馬及小腦；STAT3是細胞信號傳導途徑中重要的核轉錄因子，它介導多種細胞因子和生長因子的信號向核內傳導，影響靶基因的轉錄，調控細胞功能，對疾病的發生發展具有重要的調控作用[6]。

許多受體可以與受體活性修飾蛋白(RAMP)作用。RAMP與受體的相互作用可導致一系列效應，其中包括與受體蛋白結合運行至細胞表面產生新的受體表型。RAMP3是單一跨膜分子，當與降鈣素受體結合時，其藥學結構發生改變而成為胰淀素受體。進一步的研究[7]表明，RAMP在胞外有一個長的N端結構域，而在細胞內有一個短的C端結構域。這表明RAMP N端在重組的受體復合物耦合中起著重要作用[8]。在受體復合物被激活后，RAMP的C端決定信號轉導通路。該研究結果間接提示煙堿乙酰膽堿受體和人胰淀素受體可能通過重組的RAMP受體復合物形成新的偶聯。

該研究結果顯示人胰淀素和煙堿激活相同的通道活動，這表明人胰淀素受體和煙堿乙酰膽堿受體在基底前腦神經元膜形成了一個偶聯的受體復合物，刺激人胰淀素受體誘導構象變化，通過蛋白-蛋白之間的相互作用，直接影響細胞膜的煙堿乙酰膽堿受體。煙堿乙酰膽堿受體和人胰淀素受體復合體的N末端是激動劑和拮抗劑結合的位點。激動劑或拮抗劑與位點結合后，引起受體復合體發生結構的變化，調節細胞活性。兩個看似不同的受體可以發揮協同作用，影響神經元的興奮性。

綜上所述，胰淀素受體激活后可通過與細胞膜的膽堿能受體偶聯協同作用，影響細胞的活性，決定細胞的生與死，這對于理解阿爾茨海默病的發病機制非常有意義。

參考文獻

[1]BALLESTA JJ,DEL POZO C,CASTELL-BANYULS J,et al.Selective down-regulation of α4β2 neuronal nicotinic acetylcholine receptors in the brain of uremic rats with cognitive impairment[J].Exp Neurol,2012,236(1):28

[2]JHAMANDAS JH,LI Z,WESTAWAY D,et al.Actions of β-amyloid protein on human neurons are expressed through the amylin receptor[J].Am J Pathol,2011,178(1):140

[3]LI ZM,LI XF.Functional coupling reactions of human amylin receptor and nicotinic acetylcholine receptors in rat brain neurons[J].Sheng Li Xue Bao,2012,64(1):69

[4]PICCIOTTO MR,ZOLI M.Neuroprotection via nAChRs: the role of nAChRs in neurodegenerative disorders such as Alzheimer′s and Parkinson′s disease[J].Front Biosci,2008,13:492

[5]田密,侯德仁,鄧炎堯,等.STAT3與P-STAT3在轉基因AD小鼠腦組織中的表達及意義[J].南方醫科大學學報,2013,33(12):1778

[6]黃月,任秀花,張杰文,等.Aβ1-42單克隆抗體對阿爾茨海默病大鼠認知能力及腦組織Aβ和ChAT表達的影響[J].鄭州大學學報(醫學版),2011,46(1):88

[7]BOMBERGER JM,PARAMESARAN N,HALL CS,et al.Novel function for receptor activity-modifying proteins(RAMPs) in post-endocytic receptor trafficking[J].J Biol Chem,2005,280(10):9297

[8]PARAMESWARAN N,SPIELMAN WS.RAMPs:the past, present and future[J].Trends Biochem Sci,2006,31(11):631

中圖分類號R338.8

#通信作者，男，1960年11月生，碩士，教授，研究方向：阿爾茨海默病，E-mail:lizongming3@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.014

*河南省教育廳基金資助項目2011C180007；漯河醫學高等專科學校基金資助項目2010-S01