孕婦血漿中胎兒特異性C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測(cè)*

許雅娟，張瑩瑩，羅曉華，翟閃閃，冉利敏，任利單，洪　騰

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科 鄭州 450052

△女，1963年4月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)，E-mail：cnzzzsl@163.com

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孕婦血漿中胎兒特異性C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測(cè)*

許雅娟△，張瑩瑩，羅曉華，翟閃閃，冉利敏，任利單，洪騰

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院產(chǎn)科 鄭州 450052

△女，1963年4月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向：圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)，E-mail：cnzzzsl@163.com

關(guān)鍵詞21-三體綜合征；C21orf105；PLAC4;血漿

摘要目的：探討孕婦血漿中胎兒特異性C21orf105、PLAC4 mRNA的穩(wěn)定性及其表達(dá)量檢測(cè)的臨床價(jià)值。方法：①收集30例健康單胎妊娠婦女的血樣，分為8組，其中4組分別在室溫中放置0、6、24、72 h，余4組分別于4 ℃條件下放置0、6、24、72 h，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)C21orf105、PLAC4 mRNA。②收集健康單胎妊娠婦女的血樣，其中經(jīng)染色體核型分析證實(shí)胎兒為21-三體綜合征的孕婦38例，胎兒染色體正常的孕婦40例，同法檢測(cè)血漿C21orf105、PLAC4 mRNA。結(jié)果：30例孕婦血漿中均能檢測(cè)到C21orf105、PLAC4 mRNA，孕婦血漿室溫放置72 h后，C21orf105、PLAC4 mRNA無(wú)明顯降解(P>0.05)。21-三體綜合征胎兒孕婦血漿中C21orf105、PLACA4 mRNA表達(dá)量高于正常胎兒孕婦(P<0.001)。結(jié)論：母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA很穩(wěn)定，其檢測(cè)有望成為21-三體綜合征產(chǎn)前篩查的有效指標(biāo)。

Plasma levels of fetal-specific C21orf105 and PLAC4 mRNA of pregnant women with trisomy 21 syndrome fetus

XUYajuan，ZHANGYingying，LUOXiaohua，ZHAIShanshan，RANLimin，RENLidan，HONGTeng

DepartmentofObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordstrisomy 21 syndrome;C21orf105;PLAC4;plasma

AbstractAim: To explore the stability of the fetal-specific C21orf105 and PLAC4 mRNA and their expressions in the maternal plasma of pregnant women with trisomy 21 syndrome fetus.Methods: The plasma of 30 healthy and singleton pregnant women were collected and allocated in 8 groups, 4 groups were stored for 0,6,24 and 72 h at 4 ℃, and the other 4 groups were stored for 0,6,24 and 72 h at room temperature,respectively, then the expressions of C21orf105 and PLAC4 mRNA were detected using real-time RT-PCR.A total of 40 blood samples from normal pregnant women and 38 samples from trisomy 21 syndrome fetus pregnant women were collected to detect C21orf105 and PLAC4 mRNA in maternal plasma.Results: C21orf105 and PLAC4 mRNA could be detected in all the maternal plasma samples, even in maternal plasma samples stored at room temperature for 72 h, and there was no significant differences among the 8 groups(P>0.05).The mRNA expression levels of C21orf105 and PLAC4 in maternal plasma of the trisomy 21 syndrome pregnant women were higher than those of the normal controls(P<0.001).Conclusion: C21orf105 and PLAC4 mRNA in maternal plasma is stable enough to be amplified,and they are potential markers for prenatal screening of trisomy 21 syndrome.

21-三體綜合征是人類最常見(jiàn)的染色體疾病，發(fā)生率約1/800，絕大多數(shù)患者表現(xiàn)為嚴(yán)重智力障礙及多種臟器的異常[1]。染色體核型分析是檢測(cè)胎兒21-三體綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，但其為侵入性操作，且操作復(fù)雜,花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，費(fèi)用高，難以被孕婦接受,因此亟需一種能夠在孕早期實(shí)施且安全、簡(jiǎn)便、敏感性和特異性均較高的非侵入性產(chǎn)前篩查與診斷方法。母血中胎兒游離mRNA的發(fā)現(xiàn)為胎兒染色體非整倍體疾病的非侵入性產(chǎn)前篩查開(kāi)辟了新的方向[3]。C21orf105[4]和PLAC4[5]mRNA位于21號(hào)染色體唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)，具有胎兒特異性、妊娠特異性，孕早期即可在孕婦血漿中檢測(cè)到，產(chǎn)后迅速消失。目前孕婦血漿中C21orf105和PLAC4 mRNA表達(dá)與胎兒21-三體綜合征之間的關(guān)系尚存有爭(zhēng)議[6-8]，且對(duì)于離體血標(biāo)本的存放溫度及處理時(shí)間也無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。該研究旨在探討采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法定量分析孕婦外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA的方法穩(wěn)定性及其在胎兒21-三體綜合征產(chǎn)前篩查方面的價(jià)值。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源①選取2014年6月至9月在該院門(mén)診行圍產(chǎn)保健的健康單胎妊娠婦女30例,均為初產(chǎn)婦，年齡(27.6±5.2)歲；抽取其外周血15 mL，分為8組(A0、A1、A2、A3組和B0、B1、B2、B3組)，用于孕婦外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA穩(wěn)定性的研究。 ②2013年7月至2014年9月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院共行羊水穿刺及染色體核型分析2 100例。選擇門(mén)診行圍產(chǎn)保健的身體健康且均為單胎妊娠、經(jīng)染色體核型分析證實(shí)胎兒為21-三體綜合征的孕婦38例作為病例組，胎兒染色體正常的孕婦40例作為對(duì)照組。該兩組孕婦血漿標(biāo)本用于C21orf105、PLAC4 mRNA表達(dá)與胎兒21-三體綜合征關(guān)系的研究。

1.2母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測(cè)

1.2.1標(biāo)本處理對(duì)血標(biāo)本進(jìn)行“二步離心”處理[9]。4 ℃條件下1 600× g低速離心10 min，將上清液移入新的無(wú)RNase的EP管中；在4 ℃條件下16 000 g高速離心10 min，將上清液移入無(wú)RNase的EP管中；加入TRI 試劑(MRC公司)，于-80 ℃條件下保存。用于mRNA穩(wěn)定性研究的標(biāo)本經(jīng)“二步離心”后， A0、A1、A2、A3組于室溫中分別放置0、6、24、72 h后加入TRI試劑，B0、B1、B2、B3組于4 ℃條件下分別放置0、6、24、72 h后加入TRI 試劑，劇烈振蕩后于-80 ℃保存。

1.2.2血漿總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄血漿總RNA的提取使用美國(guó)MRC公司的TRI試劑，具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作，分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度后，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用日本TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒，總反應(yīng)體系為20 μL：12 μL RNA于65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上，加入4 μL 4×DN Master Mix(已添加gDNA Remover)，置于37 ℃條件下5 min，加入 4 μL 5×RT Master Mix Ⅱ，37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于-20 ℃保存。上述反應(yīng)液均在冰上配置。如無(wú)特殊說(shuō)明，離心條件均為4 ℃ 16 000× g離心10 min。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索C21orf105和PLAC4序列, 使用軟件Primer Express 2.0 設(shè)計(jì)PCR引物，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用康為世紀(jì)公司的UltraSYBR Mixture(With ROX)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以β-actin作為內(nèi)參基因?？偡磻?yīng)體系包括2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán);于60 ℃收集熒光信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。儀器為美國(guó)ABI 7500 real-time PCR System。采用2-ΔΔCt法計(jì)算最終結(jié)果。

表1　PCR引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析來(lái)評(píng)判血樣存放時(shí)間和溫度對(duì)C21orf105、PLAC4 mRNA測(cè)定結(jié)果的影響；病例組和對(duì)照組孕婦血漿中兩種mRNA表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)質(zhì)量評(píng)估各組PCR產(chǎn)物的溶解曲線均為單峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增等情況。孕婦血漿中均能檢測(cè)到C21orf105、PLAC4 mRNA和β-actin mRNA，檢出率為100%。

2.2孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的穩(wěn)定性以A3、B3組為例，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。8組C21orf105、PLAC4 mRNA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。標(biāo)本存放溫度和時(shí)間對(duì)血漿中C21orf105、PLAC4mRNA的測(cè)定無(wú)顯著影響，孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA穩(wěn)定性較好。

從上到下依次為C21orf105、A3組PLAC4、B3組C21orf105、B3組PLAC4。圖2　A3及B3組的擴(kuò)增曲線

t(處理)/hT(存放)室溫4℃00.044±0.0490.044±0.04960.031±0.0280.041±0.018240.045±0.0280.034±0.006720.047±0.0510.048±0.022

Ft=2.608,P=0.052；FT=0.417,P=0.519；F交互=0.244,P=0.866。

表3　孕婦血漿中PLAC4 mRNA檢測(cè)結(jié)果(n=3)

Ft=1.555,P=0.201；FT=0.408,P=0.524；F交互=0.668,P=0.573。

2.3病例組和對(duì)照組孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA表達(dá)量的比較兩組孕婦的年齡、孕齡、孕次差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)，具有可比性。病例組孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，見(jiàn)表5。

表4　兩組孕婦一般情況比較

表5　兩組孕婦血漿中

3討論

目前，胎兒染色體疾病的產(chǎn)前篩查方法有超聲學(xué)檢查及血清學(xué)篩查，但均存在敏感性和特異性低的問(wèn)題，而無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前DNA篩查技術(shù)費(fèi)用較高，不適于普遍篩查。胎兒C21orf105[4]和PLAC4[5]基因均位于21號(hào)染色體上，孕早期孕婦血漿中即能檢測(cè)到C21orf105和PLAC4 mRNA，而非妊娠婦女血漿中檢測(cè)不到，故二者有望用于21-三體綜合征的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查。

對(duì)于離體血標(biāo)本的存放溫度和處理時(shí)間，目前報(bào)道尚不統(tǒng)一，有將外周血標(biāo)本離體后置于室溫下3 h[10]、6 h[11]、24 h[12]內(nèi)處理；也有將血標(biāo)本存放于4 ℃條件下72 h[4]內(nèi)處理；Ng等[12]研究發(fā)現(xiàn)孕婦外周血離體后室溫放置24 h，hPL、hCG mRNA濃度無(wú)明顯改變。目前尚不明確是否血漿中所有的mRNA都具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，有必要研究存放溫度及處理時(shí)間對(duì)孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA穩(wěn)定性的影響。作者對(duì)此進(jìn)行了探討，研究結(jié)果顯示，存放時(shí)間和溫度對(duì)孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA水平無(wú)明顯影響,孕婦血漿中的胎兒游離C21orf105、PLAC4 mRNA具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，同Ng等[3]的研究結(jié)論相一致。孕婦血漿中胎兒游離C21orf105、PLAC4 mRNA能在室溫中穩(wěn)定存在72 h，且仍具有擴(kuò)增能力，這種穩(wěn)定性有利于對(duì)母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的檢測(cè)。

21-三體綜合征胎兒的胎盤(pán)發(fā)育發(fā)生改變，滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加，母胎界面細(xì)胞釋放增加[7]，理論上胎兒21-三體綜合征孕婦外周血中由21號(hào)染色體編碼的mRNA表達(dá)量高于正常胎兒孕婦，但是目前研究中，孕婦血漿C21orf105、PLAC4 mRNA表達(dá)量與胎兒21-三體綜合征的關(guān)系存在爭(zhēng)議。程蔚蔚等[6]研究發(fā)現(xiàn)胎兒21-三體綜合征孕婦血漿中C21orf105 mRNA水平明顯高于正常胎兒孕婦；但是Go等[4]的研究表明,21-三體綜合征胎兒孕婦與正常胎兒孕婦血漿中C21orf105 mRNA表達(dá)量并無(wú)顯著差異。2008年Banzola等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與正常胎兒孕婦血漿中PLAC4 mRNA表達(dá)水平相比，21-三體綜合征胎兒孕婦血漿中PLAC4 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變；2010年Tsui等[8]應(yīng)用real-time PCR法測(cè)定孕婦血漿中PLAC4 mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)21-三體綜合征胎兒孕婦PLAC4 mRNA表達(dá)量明顯高于正常胎兒孕婦。該研究中，作者采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)了38例21-三體綜合征胎兒孕婦及40例年齡、孕周相匹配的正常胎兒孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示，21-三體綜合征胎兒孕婦血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA表達(dá)量高于正常胎兒孕婦，提示孕婦外周血中C21orf105、PLAC4 mRNA檢測(cè)有望成為21-三體綜合征產(chǎn)前篩查的有效指標(biāo)。

綜上所述，孕婦血漿中胎兒C21orf105、PLAC4 mRNA具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，室溫中穩(wěn)定存在72 h仍具有擴(kuò)增能力。在以后的研究或臨床應(yīng)用中，可以對(duì)在室溫中存放3 d的全血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以便于基層醫(yī)院對(duì)標(biāo)本的儲(chǔ)存及運(yùn)送，實(shí)現(xiàn)一次性檢測(cè)更多的病例，可大大節(jié)約人力、物力，降低研究成本。母體血漿中C21orf105、PLAC4 mRNA可能成為21-三體綜合征產(chǎn)前篩查的有效指標(biāo)。

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中圖分類號(hào)R714.5

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.016

*河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目132300410197