柯薩奇病毒B3誘導的病毒性心肌炎C57BL/6J小鼠模型的建立

趙小建，張潔鈺，楊　帆，王　麗，張真真，唐　琳，趙洛沙

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052

?

柯薩奇病毒B3誘導的病毒性心肌炎C57BL/6J小鼠模型的建立

趙小建，張潔鈺，楊帆，王麗，張真真，唐琳，趙洛沙#

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州 450052

關鍵詞柯薩奇病毒B3；病毒性心肌炎；C57BL/6J小鼠；動物模型

摘要目的：建立由柯薩奇病毒B3(CVB3)Nancy株誘導的病毒性心肌炎(VMC) C57BL/6J小鼠模型。方法：4周齡、6周齡C57BL/6J小鼠各50只，每個年齡組隨機選取15只作為對照(腹腔注射PBS)，剩余35只腹腔接種含CVB3 Nancy株的病毒懸液(1×105 PFU/只)，于感染后第14天取心臟，行 HE染色和CD3、CD45免疫組化染色，進行病理學評價，檢測血清白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，并做心肌組織中病毒滴度檢測，采用Western blot法檢測磷酸化AKT、IkBα、GSK3β的表達。結(jié)果：4周齡小鼠造模過程中有19只(54.3%)死亡；與對照小鼠比較，模型小鼠心肌呈現(xiàn)彌漫性炎性細胞浸潤和片狀心肌細胞變性壞死, CD3、CD45陽性細胞彌漫浸潤于心肌間質(zhì)，血清IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，心肌組織中磷酸化AKT、IkBα、GSK3β表達增高(P<0.05)。6周齡小鼠造模過程中有3只(8.6%)死亡，模型小鼠心肌組織中炎癥反應輕于4周齡模型小鼠(P<0.05)。結(jié)論：成功建立了 VMC 的C57BL/6J小鼠模型, 4周齡C57BL/6J小鼠更適用于模型的建立。

Establishment of C57BL/6J mouse myocarditis model induced by coxsackievirus B3

ZHAOXiaojian，ZHANGJieyu，YANGFan，WANGLi，ZHANGZhenzhen，TANGLin，ZHAOLuosha

DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordscoxsackievirus B3;viral myocarditis;C57BL/6J mouse;animal model

AbstractAim: To establish a C57BL/6J mouse model of myocarditis induced by coxsackievirus B3(CVB3).Methods: A total of 50 male mice with 4-week-age or 6-week-age were divided into two groups: the control(n=15) were injected via intraperiton with PBS, and the model group(n=35) were injected via intraperiton with 1×105PFU CVB3. After 14 d, mice hearts were harvested for HE staining and CD3,CD45 immunohistochemistry staining，the serum levels of IL-1β,TNF-α were assayed by ELISA, the expressions of p-AKT，p-IkBα and p-GSK3β were detected by Western blot.Results: 4-week-age model group came out with a higher mortality(19/35,54.3%), HE staining showed that a great deal of inflammatory cells concentrated in the adjacent area around the myocardiocytes,which was consistent with the finding that many CD3,CD45 positive macrophages gathered in the necrosis area，TNF-α and IL-6 level were increased(P<0.05),p-AKT,p-IκBα and p-GSK3β protein expression increased(P<0.05). While the 6-week-age model group showed a lower mortality(3/35,8.6%),and the immune response to CVB3 infection was milder than 4-week-age model group(P<0.05).Conclusion: A C57BL/6J mouse model of myocarditis induced by CVB3 is successfully established，and 4-week-age mice are recommended for this model.

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是臨床常見的心血管系統(tǒng)感染性疾病，其發(fā)病以青少年為主， 其中腸道病毒尤其是柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3， CVB3) 是引起 VMC 的最常見原因[1]。一個可靠和穩(wěn)定的動物模型是心肌炎發(fā)病機制研究、 心肌炎治療及藥物篩選不可缺少的實驗工具。VMC模型現(xiàn)主要有巨細胞病毒誘導的大鼠模型及柯薩奇病毒誘導的小鼠模型。因雄性BALB/c小鼠對柯薩奇病毒相對易感，所以國內(nèi)VMC模型多采用6～8周齡雄性BALB/c小鼠[2]。同源近交雄性C57BL/6J小鼠發(fā)病程度不顯著，通常不推薦造模[3-5]。隨著基因打靶、TALAN及Cas9系統(tǒng)的應用[6]，研究某一特定基因?qū)膊〉淖饔玫靡詫崿F(xiàn)，其中以C57BL/6J小鼠為遺傳背景的基因工程小鼠在探討疾病的分子機制方面發(fā)揮了關鍵作用[7]。該研究旨在建立以C57BL/6J小鼠為對象、由CVB3 Nancy株誘導的VMC模型及其評價體系，以期為后續(xù)VMC發(fā)病機制及防治靶點的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料同源近交雄性C57BL/6J小鼠購于河南省實驗動物中心，其中4周齡小鼠50只(體重13.5～15.0 g)，6周齡小鼠50只(體重18.5～20.0 g)。CVB3 Nancy 株購于武漢大學典藏中心，經(jīng)Hela細胞和小鼠心肌傳代、滴定，并建立終濃度為 1×106PFU/mL(PFU：空斑形成單位)的病毒庫。

1.2小鼠VMC模型的建立每個年齡組小鼠各隨機選取35只(模型組)腹腔注射1×106PFU/mL 的CVB3病毒液0.1 mL；余15只作為對照，均注射等體積的PBS。

1.3小鼠一般情況觀察和記錄以病毒接種日為第0天，接種后每日觀察小鼠日常活動情況、毛皮顏色、飲食攝入量和排泄情況，記錄小鼠死亡時間。于第14天處死小鼠并取材，記錄小鼠體重(BW)，心臟質(zhì)量(HW)，計算心臟指數(shù)(HW/BW)。 同時采用空斑形成單位法，對模型小鼠進行心肌組織病毒滴度測定，病毒滴度以每g心肌組織中PFU數(shù)目的對數(shù)值表示。

1.4心臟病理組織學觀察將小鼠心臟置于氯化鉀液中使其停跳于舒張期后，于中性福爾馬林中固定，于距心底1/3處橫切為二，取心尖部分脫水包埋，常規(guī)制片，行HE及PSR染色，檢測炎癥浸潤和膠原沉積。根據(jù)炎癥浸潤面積，病理評分分為4級[8]：0 級，無浸潤；1 級，浸潤面積<25%；2級，浸潤面積 25%～；3 級，浸潤面積50%～；4 級，浸潤面積≥75%。

1.6血清炎癥因子IL-1β、TNF-α測定第14天處死小鼠前眶后靜脈采血并離心取上清，采用雙抗體夾心ELISA法測定血清IL-1β、TNF-α水平。IL-1β、TNF-α試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，操作步驟按試劑盒說明進行。在 Bio-rad酶標儀450 nm處讀取光密度值,根據(jù)標準品濃度和光密度值計算各炎癥因子的質(zhì)量濃度。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)處理。兩組間各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結(jié)果

2.1小鼠一般情況及心肌組織病毒滴度4 周齡小鼠接種CVB3后， 第2天開始出現(xiàn)進食量和進水量減少, 以后出現(xiàn)消瘦、 聳毛、 皮毛紊亂無光澤、 活動減少、蜷縮駝背、 對刺激反應淡漠或易激惹,體重明顯下降， 第4天開始出現(xiàn)死亡， 死亡高峰期出現(xiàn)在第7～10天, 至第14天共死亡19只(54.3%)。6周齡小鼠接種CVB3 后，第4天開始出現(xiàn)聳毛、皮毛無光澤、蜷縮駝背、活動減少、對刺激反應不敏感或易激惹，第6 天開始出現(xiàn)死亡，至第14天共死亡3只(8.6%)。對照小鼠均未見異常行為變化及死亡。第14天，模型小鼠心臟指數(shù)均較對照升高，結(jié)果見表1。對照小鼠心肌CVB3檢測均為陰性，模型小鼠均為陽性。4周齡模型小鼠心肌組織病毒滴度為(4.113±0.228)，6周齡模型小鼠為(3.584±0.202)，4周齡模型小鼠較高(t=8.191，P<0.001)。

2.2小鼠心臟病理組織學表現(xiàn)大體觀察，4周齡模型小鼠心臟外膜肉眼可見大量白色點狀壞死組織

以及出血點， 6 周齡模型小鼠心臟外膜肉眼可見少量白色點狀壞死組織及出血點。HE染色可觀察到，4周齡模型小鼠心肌組織中存在彌漫性炎性細胞浸潤和大量心肌細胞壞死，炎性細胞浸潤分布在溶解壞死的心肌周圍，病理評分(3.314±0.602)；6 周齡模型小鼠心肌炎性病變較4周齡模型小鼠輕，可見心肌細胞腫脹、血管擴張，淋巴細胞局灶性浸潤，心肌組織病理評分(2.438±0.504)，低于4周齡模型小鼠(t=5.312，P<0.001)。PSR染色可見, 4周齡模型小鼠紅色膠原分布在心肌壞死灶處，6 周齡模型小鼠可見少量膠原分布在心肌壞死灶邊。對照小鼠均無異常表現(xiàn)，大體觀和鏡下觀察均為正常心肌結(jié)構(gòu)。見圖1。

表1　小鼠心臟指數(shù)的變化　mg/g

1：4周齡對照小鼠；2:6周齡對照小鼠；3：4周齡模型小鼠；4:6周齡模型小鼠。圖1　小鼠心臟大體(A)觀及心肌HE(B，×100)、PSR(C，×100)染色結(jié)果

2.3小鼠心肌組織中CD3、CD45的表達見圖2。4周齡模型小鼠心肌組織中可見 CD3、CD45 陽性細胞分布于心肌間質(zhì)伴炎癥分布區(qū)；6周齡模型小鼠CD3、CD45陽性細胞也可見散在分布于較輕的炎癥分布區(qū)。

1：CD45；2：CD3；A：4周齡對照小鼠；B:6周齡對照小鼠；C：4周齡模型小鼠；D:6周齡模型小鼠。圖2　心肌組織中CD45、CD3的表達(×100)

2.4小鼠血清炎癥因子水平模型小鼠血清IL-1β、TNF-α均較對照小鼠顯著升高，且4周齡模型小鼠高于6周齡模型小鼠(表2)。

表2　小鼠血清IL-1β、TNF-α水平的比較 　 μg/L

*:與6周齡模型小鼠比較，P<0.05。

2.5小鼠心肌組織中p-AKT、p-IkBα、p-GSK3β的表達見圖3、表3。與對照小鼠相比，模型小鼠p-AKT、p-IkBα、p-GSK3β表達均增高。

圖3　Western blot結(jié)果

組別4周齡np-AKTp-IkBαp-GSK3β6周齡np-AKTp-IkBαp-GSK3β對照組151.002±0.0061.050±0.0131.041±0.001151.053±0.0431.002±0.0460.998±0.006模型組162.503±0.4612.051±0.0441.703±0.009321.182±0.0921.250±0.0391.240±0.002t124.934838.702270.0145.151191.308255.794P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

3討論

盡管國外報道[9]以C57BL/6J小鼠為遺傳背景建立VMC模型主要采用CVB3突變株，其致病力及侵襲力較Nancy株明顯增強，可成功建立C57BL/6J小鼠VMC模型，但鑒于國內(nèi)外CVB3誘導的VMC模型建立絕大多數(shù)選取標準株Nancy株，因此此次研究也選用CVB3 Nancy株。作者分別對4周齡和6周齡C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射CVB3。4周齡小鼠接種后第2天即開始出現(xiàn)進食量和進水量減少,第3天出現(xiàn)消瘦,聳毛,皮毛紊亂無光澤,活動減少,蜷縮駝背,對刺激反應淡漠或易激惹,體重出現(xiàn)明顯下降，第4天開始出現(xiàn)死亡，第14天死亡率達54.3%；小鼠心肌顯示彌漫性炎性細胞浸潤和大量心肌細胞壞死，炎性細胞浸潤分布在溶解壞死的心肌周圍，病理評分明顯高于對照；CD3、CD45 陽性細胞分布于心肌間質(zhì)伴炎癥分布區(qū)；血清IL-1β、TNF-α水平較對照明顯升高；心肌病毒滴度檢測為陽性。以上結(jié)果表明 CVB3 Nancy株感染4周齡C57BL/6J小鼠誘發(fā)了VMC并造成心肌損傷，模型建立成功，且與前人報道[10-13]的BALB/c小鼠模型特點相似。6周齡小鼠感染CVB3后，心肌組織病理表現(xiàn)、血清炎癥因子水平均較低，提示炎癥反應較輕，模型建立不理想，這可能與成年小鼠免疫功能及機體發(fā)育相對成熟有關，更不易被CVB3感染。雄性C57BL/6J小鼠一般在45～60日齡達到性成熟，70～80日齡身體發(fā)育成熟[14]。4周齡小鼠仍處于幼年，免疫功能及機體發(fā)育尚不成熟，更易受CVB3感染，產(chǎn)生更嚴重的炎癥反應及心肌損傷。該研究與國內(nèi)報道[15]的18～20 g體重(或者5～6周齡)C57BL/6J小鼠更適合建立急性VMC模型的結(jié)論不一致。但作者認為，6周齡小鼠雖然存活率較高，但所誘導的心肌炎癥反應較輕，不適合應用于VMC模型構(gòu)建，或者更適合CVB3反復感染致擴張性心肌病模型的構(gòu)建。

以往的研究常常只強調(diào)心肌細胞壞死在心肌疾病中的作用。VMC時存在細胞因子平衡紊亂, TNF-α、IL-1β、IL-6基因啟動子含有κB位點，TNF-α、IL-1β與細胞膜表面受體結(jié)合后,可激活IκB激酶復活物,使IκBα磷酸化降解,NF-κB 激活，導致炎癥基因的表達增強及細胞凋亡發(fā)生[16]。前人報道[17-18]CVB3可使PI3K-Akt-mTOR信號通路過度活化，可能通過PRAS40和PRR5L結(jié)合mTORC2加速細胞的凋亡，也可通過PI3K-Akt-GSK3β信號通路促使心肌成纖維細胞GSK-3β mRNA和蛋白表達增加，從而促進心肌成纖維細胞增殖。心肌成纖維細胞的增殖可造成心肌纖維化、心肌重塑及心肌肥厚，導致擴張型心肌病。該實驗Western blot結(jié)果顯示，VMC模型小鼠心肌組織中p-IκBα、p-AKT表達上調(diào)，提示NF-κB、PI3K-Akt-GSK3β信號通路激活，進一步提示心肌細胞炎癥反應級聯(lián)放大、凋亡壞死加劇及心肌纖維化通路激活。4周齡模型小鼠在感染CVB3第14天已經(jīng)出現(xiàn)心肌局部膠原結(jié)締組織增生，提示心肌纖維化病變在VMC急性期已經(jīng)開始，因此應在VMC急性期早期應用藥物治療。

作者總結(jié)成功建立VMC模型主要注意事項有：因病毒活性呈指數(shù)衰減，故病毒應冰浴溶解后立即腹腔注射；小鼠周齡與易感性高度相關，但與注射的CVB3活性單位的量相比，病毒易感性對模型的影響更大。該研究不足之處在于未能提供數(shù)據(jù)證明不同病毒劑量對模型的影響，后續(xù)的研究中將詳細探討腹腔注射病毒劑量對模型的影響及病毒在體內(nèi)的復制播散軌跡，以及C57BL/6J小鼠VWC模型的病毒學、病理生理學及分子生物學機制。

參考文獻

[1]KINDERMANN I,BARTH C,MAHFOUD F,et al.Update on myocarditis[J].J Am Coll Cardiol,2012,59(9):779

[2]朱詠貴,陳志衡,楊作成.病毒性心肌炎模型研究進展[J].國際病理科學與臨床雜志,2013(1):67

[3]LEIPNER C,GRüN K,SCHNEIDER I,et al.Coxsackie virus B3-induced myocarditis:differences in the immune response of C57BL/6 and Balb/c mice[J].Med Microbiol Immunol,2004,193(2/3):141

[4]ANDERSON DR,WILSON JE,CARTHY CM,et al.Direct interactions of coxsackievirus B3 with immune cells in the splenic compartment of mice susceptible or resistant to myocarditis[J].J Virol,1996,70(7):4632

[5]BECK MA,WILLIAMS-TOONE D,LEVANDER OA.Coxsackievirus B3-resistant mice become susceptible in Se/vitamin E deficiency[J].Free Radic Biol Med,2003,34(10):1263

[6]倪培凌,劉暢,陳凌懿.DNA剪刀——TALEN和CRISPR/Cas[J].中國細胞生物學學報,2014,36(1):5

[7]MISHINA M,SAKIMURA K.Conditional gene targeting on the pure C57BL/6 genetic background[J].Neurosci Res,2007,58(2):105

[8]GUI J,YUE Y,CHEN R,et al.A20(TNFAIP3) alleviates CVB3-induced myocarditis via inhibiting NF-κB signaling[J].PLoS One,2012,7(9):e46515

[9]ALTHOF N,WHITTON JL.Coxsackievirus B3 infects the bone marrow and diminishes the restorative capacity of erythroid and lymphoid progenitors[J].J Virol,2013,87(5):2823

[10]徐翼,方峰,向稚丹,等.小鼠巨細胞病毒性心肌炎模型的建立[J].中華心血管病雜志,2005,33(4):360

[11]顧平,張明雪.柯薩奇病毒性心肌炎感染模型的建立[J].中華中醫(yī)藥學刊,2011,29(5):989

[12]MUELLER AM,FISCHER A,KATUS HA,et al.Mouse models of autoimmune diseases:autoimmune myocarditis[J].Curr Pharm Des,2015,21(18):2498

[13]SUN GX,WANG HY,LIN JZ.A murine model of acute myocarditis infected by coxsackie-virus B3M[J].Chin Med J(Engl),1988,101(1):7

[14]FOX JG,BARTHOLD SW,DAVISSON MT,et al.The mouse in biomedical research[M].New york:Academic Press,2007:91

[15]LI MH,WANG XG,XIE YQ,et al.Initial weight and virus dose: two factors affecting the onset of acute coxsackievirus B3 myocarditis in C57BL/6 mouse:a histopathology-based study[J].Cardiovasc Pathol,2013,22(1):96

[16]DAWN B,XUAN YT,MARIAN M,et al.Cardiac-specific abrogation of NF-kappa B activation in mice by transdominant expression of a mutant I kappa B alpha[J].J Mol Cell Cardiol,2001,33(1):161

[17]陳志衡,楊作成.PI3K-Akt-mTOR信號通路與病毒性心肌炎[J].國際病理科學與臨床雜志,2012,32(3):226

[18]VALEN G,YAN ZQ,HANSSON GK.Nuclear factor kappa-B and the heart[J].J Am Coll Cardiol,2001,38(2):307

中圖分類號R373.2+3

#通信作者，女，1956年4月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：心血管內(nèi)科疾病，E-mail：zhaoluosha@126.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.019