microRNA-151檢測用于評價卵巢癌鉑類藥物療效的臨床價值

蘇　純，李巧云，范　梅，陸　林

1)鄭州大學第五附屬醫院婦產科 鄭州 450052　2)鄭州大學第一附屬醫院超聲科 鄭州 450052　3)鄭州大學第三附屬醫院放射科 鄭州 450052

△女，1971年6月生，本科，副主任醫師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail：suchun5h@163.com

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microRNA-151檢測用于評價卵巢癌鉑類藥物療效的臨床價值

蘇純1)△，李巧云1)，范梅2)，陸林3)

1)鄭州大學第五附屬醫院婦產科 鄭州 4500522)鄭州大學第一附屬醫院超聲科 鄭州 4500523)鄭州大學第三附屬醫院放射科 鄭州 450052

△女，1971年6月生，本科，副主任醫師，研究方向：婦科腫瘤,E-mail：suchun5h@163.com

關鍵詞卵巢癌；化療；microRNA；Bcl-2

摘要目的：探討microRNA檢測用于評價卵巢癌患者鉑類藥物療效的臨床價值。方法：研究納入接受順鉑化療的初治卵巢癌患者88例，根據ATP-TCA結果分為敏感組(45例)和耐藥組(43例)。microRNA微陣列分析2組患者血清microRNA表達的差異，并使用qRT-PCR加以驗證。繪制ROC曲線，分析microRNA-151高表達與卵巢癌化療不敏感現象的關系。體外培養SKOV3細胞并轉染pcDNA3.1-microRNA-151或pcDNA3.1空質粒，使用3 μmol/L順鉑處理細胞48 h，計算細胞存活率，同時采用qRT-PCR及Western blot檢測microRNA-151對細胞Bcl-2表達的影響。結果：與敏感組患者相比，耐藥組患者中有5種microRNA表達上調，5種microRNA表達下調。microRNA-151水平的檢測對于評價卵巢癌患者鉑類藥物療效有臨床價值(AUC=0.719, 95%CI=0.607～0.831)，高microRNA-151水平的患者發生對鉑類藥物不敏感的風險較高。高表達microRNA-151可減弱SKOV3細胞對鉑類藥物的敏感性，提高Bcl-2的表達(P均<0.05)。結論：檢測microRNA-151水平可以評估卵巢癌患者對鉑類藥物的敏感性。

Clinical value of microRNA-151 in evaluating effect of platinum drugs on patients with ovarian cancer

SUChun1),LIQiaoyun1),FANMei2),LULin3)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFifthAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500523)DepartmentofRadiology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsovarian cancer;chemotherapy;microRNA;Bcl-2

AbstractAim: To investigate the clinical value of microRNA-151 in evaluating effect of platinum drugs on patients with ovarian cancer.Methods: Eighty-eight ovarian cancer patients treated with platinum drugs were allocated into sensitive group and insensitive group according to the result of ATP-TCA test. MicroRNA microarray was used to detect the change of microRNA expression between two groups and the results was proven by qRT-PCR. The clinical value of detecting microRNA-151 was estimated by ROC curves. Furthermore, SKOV3 cells were cultured in vitro and transfected with pcDNA3.1-microRNA-151 or empty pcDNA3.1. Non-transfected SKOV3 cells and transfected SKOV3 cells were treated with 3 μmol/L cisplatin for 48 h and CCK-8 assay was used to calculate the viability of different cells. Finally, the Bcl-2 expression change induced by microRNA-151 was confirmed by qRT-PCR and Western blot.Results: Compared with sensitive group, in insensitive group,5 kinds of microRNA expression were decreased and 5 were increased.ROC curves supported that microRNA-151 had effectively clinical value to assess the sensitivity of ovarian cancer patients to platinum drugs(AUC=0.719, 95%CI=0.607-0.831). High-expressed microRNA-151 was a risk factor for ovarian cancer patients to induce resistance to platinum drugs; moreover, high-expressed microRNA-151 could induce the resistance of SKOV3 cells to platinum drugs and increase Bcl-2 expression(P<0.05).Conclusion: MicroRNA-151 could be used to evaluate the sensitivity of ovarian cancer patients to platinum drugs.

基于鉑類藥物的聯合化療方案已經成為臨床上治療實體腫瘤的成熟方案，其在卵巢癌的治療中效果較為明確[1-2]。然而，不同個體對鉑類藥物的敏感性有較大差異，一些患者對鉑類藥物的敏感性達不到預期[3]。因此對患者鉑類藥物敏感性的評估較為重要。microRNA檢測技術已經較為成熟，且對于microRNA與腫瘤化療敏感性的研究[4]已經有所報道。如有研究[5]發現，microRNA-221和microRNA-222的高表達介導細胞對阿霉素的耐藥性。microRNA-429和microRNA-196則與結腸癌一線化療藥物的治療效果密切相關[6]。還有研究[7]指出，在卵巢癌中存在microRNA表達譜的差異，且這些microRNA的表達變化可能預示卵巢癌的發生和發展。該研究旨在探討microRNA表達差異與鉑類藥物治療敏感性的關系及機制。

1對象與方法

1.1研究對象研究納入2013年1月至2014年4月于鄭州大學第五附屬醫院就診及治療的經病理學確診的卵巢癌患者88例，年齡35～75歲，中位年齡51歲。分期參照國際婦產科聯盟制定的標準，其中Ⅰ～Ⅱ期10例，Ⅲ～Ⅳ期78例。所有患者術前未經過化療、放療以及相關的內分泌或生物治療。患者半年內不曾服用免疫調節制劑和激素類藥物。Ⅰ期患者接受合理分期手術，Ⅱ～Ⅳ期患者接受細胞減滅術。所有患者術后均接受紫杉醇聯合順鉑為主的化療方案3～6個周期。術中留取新鮮癌組織標本用于藥物敏感性的檢測。血清標本于術前采集并常規低溫保存。

1.2研究對象對順鉑敏感性的檢測采用ATP-TCA體外藥敏檢測法對患者組織標本進行順鉑藥敏檢測，嚴格按照試劑盒中提供的說明書進行操作。主要步驟為：剪碎術中留取的新鮮癌組織標本，組織解離酶消化酶解后，離心并制備細胞懸液。將細胞懸液加入含0.0%、12.5%、25.0%、50.0%、100.0%血漿峰值濃度的順鉑無血清培養基中培養1周，同時設置對照，即未加藥物的陰性細胞對照及未加細胞的空白對照。培養1周后，加入ATP提取液提取細胞中的ATP，加入熒光素-熒光酶素試劑，檢測熒光值，以反映腫瘤細胞的活性。

1.3microRNA微陣列分析采集患者術前靜脈血標本并分離血清， 采用microRNA 芯片(丹麥Exiqon公司)進行microRNA 微陣列分析。采用Trizol試劑提取總RNA，采用microRNA分離試劑盒(美國Invitrogen公司)分離并純化microRNA。用T4 RNA連接酶(美國Invitrogen公司)對microRNA進行熒光標記，將帶有標記的microRNA與微陣列芯片雜交，雜交時間為12 h。雜交結束后，采用Luxscan10K/A掃描系統(博奧生物有限公司)進行芯片掃描，并用Significance Analysis of Microarrays 2.0軟件進行結果分析。

1.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證microRNA表達變化采用Pure Mini microRNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)分離提取樣本中的microRNA，采用TaqMan microRNA Reverse Transcription試劑盒(美國Life Technologies公司)反轉錄micorRNA生成cDNA，反轉錄體系和條件參考說明書。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit[寶生物工程(大連)有限公司]在7900HT Fast RT-PCR System(美國Life Technologies公司)中進行。反應體系參照試劑盒說明書。hsa-microRNA-151引物序列為：5’-CGCCTAGACTGAAGCTCCT-3’(上游)，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(下游)。hsa-microRNA-451引物序列為：5’-ACCGUUAC CAUUACUGAGUU-3’(上游)，5’-CUCAGUAAUG GUAACGGUUUUU-3’(下游)。采用microRNA-16作為內參，其引物序列為：5’-CGCGCTAGCAGCACGTA AAT-3’(上游)，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(下游)。采用2-ΔCt計算hsa-microRNA-151 和hsa-microRNA-451的表達水平，其中ΔCt=Ct目標-Ct內參。

1.5microRNA與卵巢癌患者化療敏感性的關系

根據ATP-TCA藥敏結果將患者分為順鉑敏感組和耐藥組。繪制ROC曲線驗證microRNA檢測評估敏感程度的效能，通過單因素以及logistic回歸分析確定變化的microRNA水平與療效的關系。

1.6SKOV3細胞的培養與microRNA的轉染卵巢癌SKOV3細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心細胞庫，培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基(美國Gibco公司)，培養環境為體積分數5%CO2、37 ℃。采用由上海吉瑪公司設計并構建的pcDNA3.1-microRNA-151表達質粒轉染SKOV3細胞，同時以轉染pcDNA3.1空質粒的細胞作為陰性對照。采用LipofectamineTM2000轉染試劑盒(美國Invitrogen公司)進行轉染，方法參考試劑盒說明書。

1.7microRNA-151轉染對SKOV3細胞順鉑敏感性的影響細胞分組：未經任何處理的SKOV3細胞作為對照組、3 μmol/L順鉑處理的未經轉染的SKOV3細胞、3 μmol/L順鉑處理的轉染pcDNA3.1-microRNA-151的SKOV3細胞以及3 μmol/L順鉑處理的轉染pcDNA3.1空質粒的SKOV3細胞。在96孔板中接種各組細胞懸液(100 000個/孔)，常規培養48 h，向每孔加入10 μL CCK-8試劑(上海博谷生物科技有限公司)，繼續培養4 h，用酶標儀測定450 nm處各組細胞的吸光度，按照公式細胞存活率=(實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%計算各組細胞的存活率。實驗重復3次。

1.8microRNA轉染對SKOV3細胞Bcl-2表達的影響細胞分為轉染pcDNA3.1-microRNA-151組、轉染pcDNA3.1空質粒組和未轉染組，轉染方式同1.6。收集處理后的SKOV3細胞，Trizol提取各組細胞的總RNA。采用ImProm-Ⅱ反轉錄試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司]對提取出的總RNA進行反轉錄，以合成cDNA。反轉錄體系參照試劑盒提供的說明書。采用GO Taq qPCR Master Mix試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司]對合成的cDNA進行PCR擴增。Bcl-2上游引物為5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，下游引物為5’-TG CATATTTGTTTGGGGCAGG-3’；GAPDH上游引物為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應體系和條件參照試劑盒說明書。采用2-ΔΔCt法分析各樣本Bcl-2 mRNA的表達情況。實驗重復3次。

1.9統計學處理采用SPSS 17.0進行數據處理。敏感組和耐藥組microRNA的表達水平以中位數表示，比較采用Mann-Whitney秩和檢驗；各組細胞對順鉑敏感性以及Bcl-2表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

根據ATP-TCA結果，可將所有患者分為順鉑敏感組和耐藥組。其中敏感組45例，年齡35～70歲，中位年齡53歲；耐藥組43例，年齡40～75歲，中位年齡52歲。

2.1microRNA微陣列分析結果與敏感患者相比，耐藥患者血液標本中共有10種microRNA出現了差異表達，其中5種出現降低，5種出現增高，且hsa-microRNA-415的降低程度最為顯著，hsa-microRNA-151的增高程度最為顯著，見表1。

表1　敏感組和耐藥組間10種microRNA信號強度比較

2.2qRT-PCR對hsa-microRNA-415和hsa-microRNA-151差異表達的驗證敏感組和耐藥組hsa-microRNA-415表達的中位數分別為3.410(0.192～12.381)與3.000(0.262～9.000)，差異無統計學意義(Z=0.667，P=0.611);hsa-microRNA-151表達的中位數分別為5.438(0.910～13.051)與 6.890(0.482～16.213)，差異有統計學意義(Z=2.530，P=0.032)。

2.3microRNA-151與卵巢癌患者對鉑類藥物敏感性的關系ROC曲線下面積(AUC)為0.719(95%CI=0.607～0.831)，最佳截斷值為6.05，對應的敏感性為66.7%，特異度為89.1%，見圖1。以6.05為界限，將患者microRNA-151水平<6.05劃分為低microRNA-151組，其余患者劃分為高microRNA-151組，2組患者的治療效果見表2。Logistic回歸分析證實高microRNA-151水平是患者發生化療不敏感現象的獨立危險因素，見表3。

2.4microRNA-151高表達抑制SKOV3細胞對順鉑的敏感性結果見表4。

2.5microRNA-151高表達誘導SKOV3細胞Bcl-2的高表達結果見表4、圖2。

圖1　microRNA-151評估鉑類藥物耐藥的ROC曲線

例

OR=4.139,95%CI=1.713～10.454,χ2=10.234,P<0.001。

表3　microRNA-151預測卵巢癌患者

表4　microRNA-151轉染對SKOV3細胞存活率及Bcl-2 mRNA表達水平的影響

*：與其他2組比較，P<0.05。

A：正常SKOV3細胞；B：轉染pcDNA3.1-microRNA-151質粒的SKOV3細胞；C：轉染pcDNA3.1空質粒的SKOV3細胞。圖2　microRNA-151高表達對SKOV3細胞Bcl-2表達的影響

3討論

卵巢癌是致死率較高的婦科惡性腫瘤，70%的患者在明確診斷時已為晚期。目前，臨床治療卵巢癌的方案是腫瘤細胞減滅術聯合化療。化療的常用方案是以鉑類為主的聯合化療，因為鉑類藥物具有費用低、不良反應少、效果明確且抗癌譜廣泛的優點[8]。順鉑是常用的鉑類藥物，報道[9]稱以順鉑為主的聯合化療的完全緩解率應為60%左右，但實際的臨床效果卻低于此。越來越多的證據[10]表明microRNA的差異表達與腫瘤細胞對化療藥物的敏感性有關。通過microRNA芯片檢測，作者發現了對鉑類藥物治療不敏感的患者存在microRNA-151的高表達，且microRNA-151轉染可降低SKOV3細胞對順鉑的敏感性。

microRNA影響化療敏感性的機制較復雜[11]。該研究選取凋亡調控因子Bcl-2作為研究點。大量研究[12-14]表明Bcl-2的表達與腫瘤對化療藥物的敏感性有關，Bcl-2高表達時，氟尿嘧啶、長春新堿、表阿霉素、奧沙利鉑對腫瘤細胞的抑制率明顯降低。該研究發現microRNA-151的轉染可導致SKOV3細胞Bcl-2的表達顯著增高，因此推測microRNA-151表達增高可能增加Bcl-2的表達水平，減少凋亡，從而降低卵巢癌患者對鉑類藥物的敏感性。當然，該研究未能闡述microRNA-151如何增加Bcl-2的表達，也未能闡述除Bcl-2外還有哪些凋亡調控因子與microRNA-15有關，這有待于進一步研究。

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中圖分類號R737.31

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.021