黃芪甲苷對過氧化氫誘導損傷的人臍靜脈內皮細胞的保護作用

馬海濤,王　輝

1)河南中醫學院第一附屬醫院周圍血管科 鄭州 450000　2)河南中醫學院藥學院中藥教研室 鄭州 450000

△男,1969年6月生，本科，副主任醫師，研究方向：中西醫結合治療周圍血管疾病，E-mail：mahaitao6968@126.com

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黃芪甲苷對過氧化氫誘導損傷的人臍靜脈內皮細胞的保護作用

馬海濤1)△,王輝2)

1)河南中醫學院第一附屬醫院周圍血管科 鄭州 4500002)河南中醫學院藥學院中藥教研室 鄭州 450000

△男,1969年6月生，本科，副主任醫師，研究方向：中西醫結合治療周圍血管疾病，E-mail：mahaitao6968@126.com

關鍵詞下肢缺血；血管內皮細胞；DNA損傷；黃芪甲苷；Wnt/β-catenin信號通路

摘要目的：探討黃芪甲苷對過氧化氫誘導損傷的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的保護作用，并初步探討其作用機制。方法：實驗Ⅰ中取HUVECs后分為5組，其中4組分別給予不同質量濃度的黃芪甲苷預處理后，用過氧化氫誘導建立HUVECs損傷模型，對照組不處理。實驗Ⅱ中另取HUVECs分為4組，即對照組、LiCl組、黃芪甲苷組及LiCl+黃芪甲苷組，后3組按分組處理后均同上用過氧化氫誘導。采用MTT法檢測上述各組細胞存活情況，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot分析γ-H2AX、β-catenin蛋白的表達。結果：過氧化氫可抑制HUVECs存活，誘導其凋亡，而黃芪甲苷可改善上述情況(P<0.05)。Wnt通路激動劑LiCl預處理后，黃芪甲苷對損傷HUVECs的保護作用減弱，同時DNA損傷標記分子γ-H2AX以及β-catenin蛋白的表達水平升高(P<0.05)。結論：黃芪甲苷可緩解氧化應激誘導的HUVECs損傷，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

Protective effects of astragaloside on injured human umbilical vein endothelial cells induced by H2O2

MAHaitao1),WANGHui2)

1)DepartmentofPeripheralVascular,theFirstAffiliatedHospital，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500002)DepartmentofTraditionalChineseMedicine，CollegeofPharmacy,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000

Key wordshindlimb ischemia;vascular endothelial cell;DNA injury;astragaloside;Wnt/β-catenin signaling pathway

AbstractAim: To study the effect and the underlying mechanism of astragaloside on injured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) induced by H2O2. Methods: In experiment Ⅰ, HUVECs were allocated into 5 groups,among which, 4 groups were pretreated by astragaloside at different doses and then treated by H2O2，and the control group was not treated. In experiment Ⅱ, HUVECs were allocated into 4 groups as control group, LiCl group, astragaloside group, and LiCl+astragaloside group and treated accordingly,and then they were treated by H2O2，and the control group was not treated.MTT assay was used to assess the survival of HUVECs, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. Furthermore, the expression levels of γ-H2AX and β-catenin protein were detected by Western blot. Results: Astragaloside attenuated the inhibitory effect of H2O2on cell survival and down-regulated the apoptosis rate of HUVECs induced by H2O2. Further mechanism analysis showed that pretreatment with LiCl attenuated the protecting effect of astragaloside on HUVECs with an obvious increase in the expression levels of γ-H2AX and β-catenin protein(P<0.05). Conclusion: Astragaloside could protect the HUVECs from oxidative stress mainly by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway.

下肢缺血性疾病在周圍血管疾病(peripheral artery disease,PAD)中最為常見，部分甚至可發展成嚴重肢體缺血，患者最后不得不承受截肢的痛苦，嚴重影響患者的生活質量[1]。目前臨床上治療下肢缺血的方法主要有藥物治療和手術治療等，但效果并不理想。研究[2]證實，血管阻塞后大量的氧自由基誘發的內皮細胞DNA損傷是影響下肢缺血病理進程的重要因素。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分，是一種相對分子質量較小的皂苷，有保護血管、抗衰老、抗氧化等作用[3-4]。近年研究[5-6]表明，中藥黃芪可有效恢復3,4苯并芘誘導的內皮祖細胞功能損傷，并參與糖尿病血管重構等多種疾病的病理進程，對由內皮功能障礙引起的一些心血管疾病的防治具有重要作用。該研究中作者建立了過氧化氫誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)氧化應激損傷細胞模型，模擬血管阻塞后氧自由基誘發的HUVECs損傷，觀察不同質量濃度的黃芪甲苷預處理對HUVECs的保護作用，并進一步探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1材料HUVEC細胞株(中科院上海細胞庫)，DMEM高糖培養液(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，兔抗人γ-H2AX、β-catenin抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，鼠抗人β-actin抗體(CST公司)，黃芪甲苷(上海融禾公司)，AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、熒光染料碘化丙啶(PI)(Invitrogen公司)，MTT、Wnt通路激動劑LiCl(Sigma公司)，過氧化氫(國藥化學試劑公司)。

1.2HUVECs的復蘇及培養采用快速融化法復蘇細胞，用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的高糖DMEM完全培養液將細胞配成2×106mL-1的懸浮液，置于6孔板中，每孔2 mL,于37 ℃、體積分數5% CO2條件下常規培養。取對數生長期的HUVECs接種于96孔板，每孔200 μL。實驗Ⅰ分組如下：對照組(不加任何干預因素)，模型組(在細胞培養體系中加入終質量濃度為100 μmol/L的過氧化氫作用0.5 h)，低、中、高劑量黃芪甲苷組(加入終質量濃度分別為2、10和50 mg/L的黃芪甲苷預處理24 h后再同上加入過氧化氫作用0.5 h)。實驗Ⅱ分組如下：對照組(不加任何干預因素)、黃芪甲苷組(加入終質量濃度為50 mg/L的黃芪甲苷預處理24 h后再加入過氧化氫作用0.5 h)、LiCl組(加入終質量濃度為10 mmol/L的LiCl作用24 h后再加入過氧化氫作用0.5 h)和黃芪甲苷+LiCl組(同時加入終質量濃度為50 mg/L的黃芪甲苷和10 mmol/L的LiCl共同作用24 h后同上加入過氧化氫作用0.5 h)。

1.3各組細胞存活情況檢測采用MTT法。細胞按實驗Ⅰ分組處理后加入10 μL 5 g/L MTT溶液，孵育4 h，棄上清，按每孔100 μL加入DMSO，振蕩10 min，酶標儀490 nm處讀取吸光度(A)值。每組設6個復孔。另取細胞，按實驗Ⅱ分組處理后同上檢測，每組設3個復孔。

1.4各組細胞凋亡率檢測采用流式細胞術。細胞分別按實驗Ⅰ、實驗Ⅱ分組處理后用胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，立即加入10 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，振蕩混勻，避光，室溫孵育15 min后與300 μL結合緩沖液混合，加入流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算細胞凋亡率。重復檢測3次。

1.5各組細胞γ-H2AX、β-catenin蛋白表達的檢測

1.6統計學處理應用SPSS 13.0處理數據。采用單因素方差分析比較實驗Ⅰ中各組HUVECs的存活情況(A值)、細胞凋亡率、γ-H2AX及β-catenin蛋白的表達水平，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；采用析因設計的方差分析比較實驗Ⅱ中各組HUVECs的存活情況(A值)、細胞凋亡率以及γ-H2AX、β-catenin蛋白的表達水平，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1不同劑量黃芪甲苷對HUVECs存活、細胞凋亡及γ-H2AX、β-catenin蛋白表達的影響見表1。由表1可知，過氧化氫刺激可抑制HUVECs存活，促進HUVECs凋亡，而黃芪甲苷可呈劑量依賴性地改善上述情況；此外，黃芪甲苷可抑制DNA損傷標記分子γ-H2AX和Wnt通路下游關鍵靶分子β-catenin蛋白表達水平的升高。

表1　實驗Ⅰ中5組細胞存活情況、

*：與對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05。

2.2黃芪甲苷及LiCl對HUVECs存活、凋亡及γ-H2AX和β-catenin蛋白表達的影響見圖1、表2。由表2可知，LiCl與黃芪甲苷共同孵育細胞24 h后，黃芪甲苷對HUVECs的保護作用被削弱。

1、2、3、4：分別為對照組、黃芪甲苷組、LiCl組和黃芪甲苷+LiCl組。圖1　實驗Ⅱ中4組HUVECs中γ-H2AX和β-catenin蛋白的表達

組別nA值細胞凋亡率/%γ-H2AXβ-catenin對照組31.22±0.074.4±0.20.29±0.040.38±0.07黃芪甲苷組31.03±0.0918.8±2.30.52±0.070.61±0.09LiCl組30.42±0.1142.2±3.01.74±0.131.58±0.11黃芪甲苷+LiCl組30.61±0.1234.6±2.01.31±0.121.29±0.12F黃芪甲苷(P)<0.001(>0.999)7.575(0.025)3.175(0.113)0.275(0.615)FLiCl(P)113.043(<0.001)470.131(<0.001)398.222(<0.001)268.435(<0.001)F交互(P)10.967(0.011)79.188(<0.001)34.571(<0.001)20.537(0.002)

3討論

PAD嚴重威脅人類的健康，血管阻塞后致下肢發生缺血、缺氧性改變，最終導致血管內皮細胞的損傷[7]。研究[8]表明，血管內皮的損傷可導致炎性細胞浸潤，血管平滑肌細胞增殖，造成血管粥樣硬化以及再狹窄，是血管損傷后不能很好修復的主要原因之一。因此，修復血管內皮損傷和保護內皮功能成為近年來PAD防治的關鍵。

近年來，中醫學在防治血管內皮損傷及其功能障礙等方面取得了一定進展。有學者[9]從中藥有效成分入手進行了大量研究，結果表明，皂苷類作為一些益氣藥的主要活性成分，具有血管保護作用。黃芪甲苷是傳統的補氣藥黃芪的主要成分之一。該實驗結果表明，黃芪甲苷可增強氧化應激條件(過氧化氫處理)下HUVECs的增殖，抑制其凋亡。在PAD的病理過程中，氧自由基扮演著十分重要的角色，大量氧自由基的產生導致DNA損傷的發生，使下肢發生不可逆性損傷[10]。DNA雙鏈斷裂是機體DNA損傷的類型之一，而γ-H2AX的形成就是DNA雙鏈斷裂的一個標志[11]。該研究結果顯示黃芪甲苷預處理可降低過氧化氫誘導的γ-H2AX蛋白的表達，對抗氧化應激導致的HUVECs DNA損傷。

Wnt信號通路在血管再生的生理和病理過程中扮演著十分重要的角色，Wnt配體、受體在血管內皮細胞中均有表達[12]。研究[13-14]表明，下肢缺血損傷發生時，在體內、體外應用Wnt信號通路阻滯劑DKK1可有效促進缺血區血管再生；而Wnt通路的另一阻滯劑sFRP-1在肢體缺血后能作為血管再生因子發揮作用。由此可見，抑制Wnt信號通路可在缺血、缺氧引起的損傷中對細胞起到保護作用[15]。β-catenin作為經典Wnt信號通路的下游分子在血管生理進程中起著關鍵作用。研究[16]發現，Wnt因子可能通過調控β-catenin的表達來調節內皮細胞的信號傳導。該研究結果表明氧化應激條件下，HUVECs中β-catenin表達升高，而黃芪甲苷預處理可抑制β-catenin的表達，提示黃芪甲苷可能是通過抑制β-catenin的活性發揮對氧化應激造成的細胞損傷的保護作用；當用Wnt通路激動劑LiCl預處理后，黃芪甲苷對β-catenin的抑制作用減弱；此外，LiCl可減弱黃芪甲苷預處理對過氧化氫作用下細胞的保護作用，表明黃芪甲苷可能主要通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來保護氧化應激下損傷的HUVECs。

綜上所述，黃芪甲苷可緩解氧化應激條件下HUVECs的損傷，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

參考文獻

[1]舒暢,何昊.下肢缺血性疾病的診治進展[J].中國普通外科雜志,2008,17(6):523

[2]彭錦輝.IGFBP-4保護下肢缺血性損傷的實驗研究[D].上海:第二軍醫大學,2013.

[3]劉曉丹,鄧常清.黃芪甲苷和三七總皂苷中主要有效成分抗PC12細胞氧化損傷的配伍研究[J].湖南中醫藥大學學報,2012,32(1):8

[4]熊平,蔣靈芝,廖秀清.黃芪甲苷保護大鼠肺缺血再灌注肺損傷的形態學研究[J].南方醫科大學學報,2010,30(8):1864

[5]賀爽,郭浩,徐硯通,等.中藥促進內皮祖細胞功能治療血管損傷性疾病的研究進展[J].中華中醫藥雜志,2013,28(12):3612

[6]楊長春,韓盈.黃芪、當歸對血管再狹窄大鼠超聲血流動力學的影響[J].解放軍醫學雜志,2010,35(8):976

[7]史洪濤,申東彥,邢桃紅.膝下動脈腔內成形術治療重癥下肢缺血86例[J].鄭州大學學報(醫學版),2010,45(4):690

[8]STORM T,WULF K,TESKE M,et al.Chemical activation and changes in surface morphology of poly(ε-caprolactone) modulate VEGF responsiveness of human endothelial cells[J].J Mater Sci Mater Med,2014,25(8):2003

[9]劉斌,王新宇,孫曉雪,等.參芎化瘀膠囊預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管內皮生長因子表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(9):284

[10]KALGHATGI S,KELLY CM,CERCHAR E,et al.Effects of non-thermal plasma on mammalian cells[J].PLoS One,2011,6(1):e16270

[11]劉靜.氧化應激損傷在赭曲霉毒素A誘導細胞周期阻滯中的作用及其可能機制的研究[D].石家莊:河北醫科大學,2012.

[12]DEJANA E.The role of wnt signaling in physiological and pathological angiogenesis[J].Circ Res,2010,107(8):943

[13]SMADJA DM,D'AUDIGIER C,WEISWALD LB,et al.The Wnt antagonist Dickkopf-1 increases endothelial progenitor cell angiogenic potential[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(12):2544

[14]DUFOURCQ P,LEROUX L,EZAN J,et al.Regulation of endothelial cell cytoskeletal reorganization by a secreted frizzled-related protein-1 and frizzled 4- and frizzled 7-dependent pathway: role in neovessel formation[J].Am J Pathol,2008,172(1):37

[15]SHRUSTER A,BEN-ZUR T,MELAMED E,et al.Wnt signaling enhances neurogenesis and improves neurological function after focal ischemic injury[J].PLoS One,2012,7(7):e40843

中圖分類號R285.5

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.027