硫氫化鈉對糖尿病視神經病變大鼠氧化應激及血漿睫狀神經營養因子水平的影響

冉瑞金

(湖北民族學院附屬民大醫院眼科，湖北　恩施　445000)

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硫氫化鈉對糖尿病視神經病變大鼠氧化應激及血漿睫狀神經營養因子水平的影響

冉瑞金

(湖北民族學院附屬民大醫院眼科，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討外源性硫化氫(H2S)供體硫氫化鈉(NaHS)對糖尿病(DM)大鼠視神經病變(DON)的防治作用及其對氧化應激睫狀神經營養因子(CNTF)的影響。方法在50只 SD大鼠隨機抽取10只作為對照組，另40只建立DON模型，對32只造模成功大鼠以隨機數字表法隨機分為DM模型組和NaHS處理組，各16只。NaHS處理組通過玻璃體腔注射NaHS生理鹽水溶液(劑量為100 μmol/kg體重)，對照組和DM模型組注射等量生理鹽水，1次/d，共8 w。對三組大鼠的視神經髓鞘切片行勞克堅牢藍染色，觀察三組切片中視神經髓鞘結構的組織病理學改變，并比較髓鞘所占比率的差異，以紫外分光光度法測定血漿中的H2S水平，分別采用試劑盒檢測血漿中氧化應激指標活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，酶聯免疫法(ELISA)試劑盒檢測血漿CNTF水平。結果8 w后三組大鼠血漿中H2S水平比較差異顯著，且NaHS處理組高于DM模型組和對照組(P<0.05)；顯微鏡下可見DM模型組與NaHS處理組大鼠的視神經髓鞘結構出現明顯潰變，NaHS處理組潰變程度較DM模型組明顯減輕，兩組髓鞘比率顯著低于對照組，而NaHS處理組高于糖尿病模型組(P<0.05)；DM模型組和NaHS處理組大鼠的ROS和MDA水平顯著高于對照組，而NaHS處理組水平低于DM模型組(P<0.05)；DM模型組和NaHS處理組大鼠的SOD水平及CNTF水平均低于對照組，而NaHS處理組水平高于DM模型組(P<0.05)。結論玻璃體腔注射NaHS可作為外源性H2S供體，提高體內的H2S水平，而H2S可以防治DON，其機制可能與改善氧化應激損傷，提高血漿中CNTF水平有關。

〔關鍵詞〕糖尿病；視神經病變；硫氫化鈉；氧化應激；睫狀神經營養因子

目前對于糖尿病視神經病變(DON)的發生發展機制尚不明確，有研究認為DON的發生與高糖狀態引起的氧化應激有關〔1〕。睫狀神經營養因子(CNTF)是一種非靶源性神經營養因子，來源于神經膠質細胞，在整個神經系統的發育、分化和損傷的修復中發揮重要作用〔2〕。近年來CNTF對視網膜神經損傷的修復作用受到學者的廣泛關注，成為目前神經疾病中研究最多的神經保護因子。硫化氫(H2S)是近年來研究較多的第三種氣體信號分子，存在于內臟、心血管系統和神經系統中，具有廣泛的生物學作用。研究發現H2S是一種內源性神經保護劑〔3〕，可清除氧自由基，抑制神經細胞的氧化應激損傷。本研究以硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的外源性供體，旨在分析其對DON大鼠的氧化應激及血漿CNTF的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選取50只清潔級成年雄性SD大鼠(由南華大學實驗動物學中心提供)，體重200~300 g。于動物實驗室自由進食喂養，室溫(22.0±3.0)℃，濕度50%~75%，自然光照，適應性喂養1 w。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器酶標儀(芬蘭Thermo Labsystem公司)，紫外分光光度計(UV-2450，日本島津公司)，生物顯微鏡(BXP-102，上海光學儀器廠)，Image-ProPlus6.0圖像分析軟件。

1.2.2試劑NaHS(美國Sigma公司)，CNTF酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測試劑盒(上海微蒙生物技術有限公司)，活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(均由南京建成生物工程有限公司提供)。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠模型制備與分組按單純隨機抽樣方法從50只大鼠中隨機抽取10只作為對照組，其余40只用于制備DON模型。造模方法如下：禁食12 h后由尾靜脈注射鏈脲佐菌素(劑量為50 mg/kg體重)，于代謝籠中飼養，控制飲水量≥40 ml/d，72 h后采集大鼠尾靜脈血測隨機血糖，并收集尿液行尿糖定性檢測。糖尿病(DM)模型制備成功的判斷標準：隨機血糖值>16.7 mmol/L，尿糖定性為以上，持續3 w。共有32只大鼠造模成功，模型成功率80.0%。以隨機數字表法將其分為DM模型組和NaHS處理組各16只。

1.3.2處理方法對NaHS處理組大鼠玻璃體腔注射NaHS生理鹽水溶液(劑量為100 μmol/kg體重)，對照組和DM模型組大鼠注射等量生理鹽水。1次/d，持續8 w。

1.4觀察指標8 w后，采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通過心臟放血收集血液，肝素抗凝，2 h內以1 500 r/min離心10 min，分離血清與血漿，-20℃凍存待用。

1.4.1血漿H2S水平將血漿標本置于室溫下解凍，分別取0.6 ml 10 g/L的醋酸鋅和0.2 ml上清液混勻，然后依次加入0.6 ml 20 mmol/L的對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽、0.6 ml 30 mmol/L三氯化鐵、0.6 ml 100 g/L三氯乙酸和25 ml去離子水，充分震蕩均勻，于室溫下孵育20 min。用紫外可見分光光度計于670 nm波長下檢測吸光度，繪制標準曲線，計算血漿中H2S的濃度。

1.4.2大鼠視神經髓鞘結構的組織病理學改變取出一側視神經完全的眼球，經磷酸鹽緩沖液(PBS)反復清洗、10%的中性甲醛固定48 h后，常規脫水、浸蠟、包埋，制成厚度為10 μm的切片。行勞克堅牢藍染色，于光學顯微鏡下觀察視神經髓鞘的結構，以Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測定神經束及相同神經束內髓鞘的橫截面積，以髓鞘橫截面積/神經束橫截面積得到髓鞘所占比率。可反映視神經髓鞘損傷的嚴重程度，其值越低，髓鞘損傷越嚴重。

1.4.3血漿中氧化應激指標嚴格按照試劑盒要求的操作方法，根據化學比色法分別測定勻漿上清中氧化應激指標水平，包括ROS、MDA和SOD水平。

1.4.4血漿CNTF水平采用ELISA法CNTF試劑盒檢測血漿中CNTF的水平，操作過程嚴格按說明書進行。

1.5統計學方法采用SPSS14.0軟件進行因素方差分析和SNK-q檢驗。

2結果

2.1三組大鼠血漿H2S水平比較三組大鼠經8 w處理后，NaHS處理組、DM模型組、對照組血漿中H2S水平分別為(90.61±10.26)μmol/L、(40.42±5.34)μmol/L、(75.18±9.01)μmol/L，三組比較差異顯著(F=10.125，P<0.01)，兩兩比較結果顯示，NaHS處理組血漿中H2S水平高于DM模型組和對照組(P<0.05)。說明經玻璃體腔注射NaHS可顯著增加大鼠體內的H2S水平，可作為外源性H2S的供體。

2.2三組大鼠視神經髓鞘結構的組織病理學改變光學顯微鏡下觀察可見，對照組大鼠視神經纖維由隔膜分成束狀，排列整齊，髓鞘染色均勻，視神經束厚度與髓鞘直徑一致。DM模型組大鼠視神經纖維排列紊亂，髓鞘大量脫失潰變，間質水腫變性，有的呈半環狀或空白，可見空泡和崩解碎片。NaHS處理組大鼠視神經髓鞘潰變狀況較DM模型組明顯減輕。

NaHS處理組、DM模型組、對照組大鼠的髓鞘所占神經束的比率分別為(18.62±10.04)%、(12.58±4.28)%及(21.94±12.37)%，比較差異顯著(F=7.149，P<0.01)。兩兩比較結果顯示，DM模型組與NaHS處理組大鼠的髓鞘比率顯著低于對照組，而NaHS處理組高于DM模型組(P<0.05)。

2.3三組大鼠血漿中氧化應激指標水平比較ROS、MDA和SOD水平差異均有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較結果顯示，DM模型組和NaHS處理組大鼠的ROS〔(1 092.35±110.34)au,(532.16±71.54)au〕和MDA〔(10.61±0.96)μmol/L,(6.21±0.69)μmol/L〕水平均顯著高于對照組〔(387.56±54.31)au,(5.34±0.51)μmol/L〕，NaHS處理組水平低于DM模型組；而DM模型組和NaHS處理組大鼠的SOD水平〔(51.38±6.42)kU/L,(103.84±9.16)kU/L〕均低于對照組〔(131.96±11.09)kU/L〕，NaHS處理組水平高于DM模型組(P<0.05)。

2.4三組大鼠血漿中CNTF水平比較NaHS處理組、DM模型組、對照組大鼠血漿中的CNTF水平分別為(8.27±1.16)nmol/L、(3.84±0.92)nmol/L及(10.29±1.52)nmol/L，比較差異顯著(F=4.910，P=0.042)。兩兩比較結果顯示，DM模型組與NaHS處理組水平均顯著低于對照組，而NaHS處理組高于DM模型組(P<0.05)。

3討論

CNTF是目前受到學者廣泛關注的非靶源性神經營養因子，主要產生于視網膜Müller細胞，來源于神經膠質細胞，可誘導視網膜節細胞(RGC)的分化、促進軸突的再生、減少RGC凋亡，改善組織內微環境，促進神經元的存活、防止神經元變性。因此，其對視神經病變的修復作用十分關鍵，而體內CNTF的減少將引起和加重視神經損傷。

H2S是一種新型的氣體信號分子，在內臟、心血管系統和神經系統中分布廣泛。其分子量小、水溶性好、還原性強，是一種有效的抗氧化應激物質。在體內以氣體和NaHS兩種形式存在，NaHS在體內可解離為Na+和HS-，HS-與H+結合生成H2S，兩者在體內形成一種動態平衡，以保證了體內H2S水平的穩定，同時可維持內環境的pH值水平。研究顯示，H2S在心血管、神經等多種系統中發揮重要的調節作用，對大鼠高血壓〔7〕、心肺等內臟臟器損傷〔8〕作用顯著。其作用機制主要涉及抗氧化、抗感染及抗凋亡等作用。本研究說明H2S對視神經病變具有保護作用。

本研究結果提示DM可使大鼠產生氧化應激損傷，從而降低了血漿中的CNTF水平，造成視神經病變。說明大鼠發生DON的發生機制與體內的氧化應激損傷和CNTF水平降低有關。另外H2S對視神經病變的保護作用機制可能與改善體內的氧化應激損傷和增加CNTF水平有關。本次研究結果與以往研究相符〔9，10〕。

綜上所述，DON的發生發展可能與機體的氧化應激和CNTF水平相關，H2S對DON的防治作用可能是通過改善體內的氧化應激損傷和提高CNTF水平實現，這可以作為今后治療DON的新靶點，為研究DON的預防和治療策略提供新的途徑和思路。然而這只是小樣本動物實驗的結果，臨床DON 的應用還有待進一步人群試驗的研究和證實。

4參考文獻

1施麗麗，任明山，吳元潔，等.糖尿病周圍神經病變與氧化應激研究現狀〔J〕.安徽醫科大學學報，2012;47(1)：94-6.

2Wang K，Zhou F，Zhu X，etal.Neuroprotective properties of ciliary neurotrophic factor on retinoic acid (RA)-predifferentiated SH-SY5Y neuroblastoma cells〔J〕.Fulia Neuropathol，2014;52(2)：121-7.

3Kimura Y，Goto Y，Kimura H.Hydrogen sulfide increase glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria〔J〕.Antioxid Redox Signal，2010;12(1)：1-13.

4蔣笑晨，劉潤奇，虞蕾楠，等.糖尿病對乳腺癌患者預后影響的Meta分析〔J〕.現代生物醫學進展，2015;15(8)：1479-82.

5任春久，張瑤，崔為正，等.氧化應激在2型糖尿病發病機制中的作用研究進展〔J〕.生理學報，2013;65(6)：664-73.

6舒毅，鐘歷勇.氧化應激與糖尿病〔J〕.東南大學學報(醫學版)，2005;24(1)：64-7.

7賈坤.硫化氫對腎血管性高血壓大鼠頸動脈竇壓力感受性反射的調節作用〔D〕.石家莊：河北醫科大學碩士論文，2011.

8謝英花，張楠，馬燕山，等.硫氫化鈉抑制離體大鼠急性心肌缺血損傷作用的線粒體機制〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志，2015;29(1)：27-32.

9冉瑞金，張學東，杜利.硫化氫與眼底病〔J〕.中國實用眼科雜志，2013；31(12)：1519-22.

10Ran R,Du L,Zhang X,etal.Elevated hydrogen sulfide levels in vitreous body and plasma in patients with proliferative diabetic retinopathy〔J〕.Retina,2014;16(4):2003-9.

〔2015-07-18修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R587

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1585-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.021

基金項目：湖北省教育廳2015年度科研項目計劃(No.Q20151901)

第一作者：冉瑞金(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事眼底病，眼外傷方面的研究。