AQP1基因沉默對前列腺癌PC-3細胞的影響

牛文斌　孔祥波　馬永亮　程　亮　張東升

(佳木斯大學第一附屬醫院泌尿外科，黑龍江　佳木斯　154002)

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AQP1基因沉默對前列腺癌PC-3細胞的影響

牛文斌孔祥波1馬永亮程亮張東升

(佳木斯大學第一附屬醫院泌尿外科，黑龍江佳木斯154002)

〔摘要〕目的探討水通道蛋白1(AQP1)基因沉默對在前列腺癌PC-3細胞的作用。方法培養PC-3細胞至對數生長期，隨機分為質粒轉染組和質粒空白組。針對AQP1基因設計合成小片段RNA，并構建高效表達載體。利用轉染試劑Lipofectamine(TM)2000用脂質體介導的基因轉染技術將質粒轉染入PC-3細胞。RT-PCR 檢測PC-3細胞AQP1 mRNA的表達情況及激光共聚焦觀察室觀察、拍照AQP1表達的情況，轉染后72 h。將鼠齡為6 w的60只BALB/c(nu-/nu-)雄裸鼠隨機分成兩組，其中對照組30只，轉染組30只。轉染組把轉染后的前列腺癌PC-3細胞注射裸鼠腋窩處皮下(對照組把未經轉染的前列腺癌PC-3細胞注射到裸鼠腋窩處皮下)。每日觀察腫瘤生長及體重情況，裸鼠飼養6 w處死，完整取出移植瘤瘤體測量體積和重量。結果與質粒空白組相比，轉染組應用RNA干擾技術后AQP-1在前列腺癌PC-3細胞系中mRNA的水平降低，與對照組相比，轉染組裸鼠移植瘤體積為(573.39±175.24)mm3 明顯小于對照組(1 482.50±327.86)mm3(P=0.03)。轉染組腫瘤重量為(0.55±0.11)g明顯小于對照組〔(1.31±0.29)g，P= 0.027〕。結論AQP-1廣泛的表達在正常前列腺組織和前列腺癌組織中，對內環境穩態起著重要的作用。更多的AQP-1促進了前列腺癌細胞的增長，抑制AQP-1的表達可以使前列腺癌移植瘤生長減慢，體積減小。

〔關鍵詞〕水通道蛋白1(AQP1);前列腺癌

前列腺癌有明顯的地區差異和種族差異〔1〕。在我國，近年因為老齡人口增多，同時各種先進儀器設備的大量出現及診斷前列腺癌的方法不斷改進，前列腺癌的發病率不斷增高〔2〕。水通道蛋白(AQP)-1高度表達于許多腫瘤細胞和腫瘤組織血管內皮細胞，增加腫瘤上皮和血管對水的通透性運輸，促進腫瘤的生長及向周圍基質浸潤〔3〕。以往研究表明AQP1在前列腺癌組織中高表達〔4〕，本實驗應用RNA干擾(RNAi)技術和裸鼠前列腺癌移植瘤模型，探討AQP1的高表達對前列腺癌PC-3細胞和移植瘤組織的影響。

1材料和方法

1.1實驗材料人前列腺癌PC-3細胞株(ATCC細胞系)購自中國科學院細胞庫，所郵寄的細胞為活細胞。實驗所用裸鼠品系為60只6周齡體重均勻的BALB/c(nu-/nu-)裸鼠，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物飼養于佳木斯大學動物實驗中心的小鼠飼養隔離器內。

1.2前列腺癌PC-3細胞AQP1免疫組化檢測人前列腺癌PC-3細胞按上海中科院細胞庫推薦的培養條件，使用含10%胎牛血清的F12培養液，置于37℃，5%二氧化碳(CO2)細胞培養箱中培養，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況和細胞生長狀態等。待細胞融合度約70%時，吸出培養液。加入0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS)2 ml，作用5 min后吸出棄掉，重復洗片3次。之后加4%多聚甲醛1 ml固定30 min。再次用PBS洗3次，每次5 min。棄掉PBS后加入1%BSA封閉液進行封閉，室溫下作用30 min后棄掉BSA封閉液，不用PBS清洗。每塊六孔板中的3個孔加入200 μl一抗(兔多克隆抗AQP1一抗，1∶100倍稀釋)，另外3個孔對照組加等量抗體稀釋液，不加兔多克隆抗AQP1一抗。做好標記，4℃過夜(或37℃孵育2 h)。加一抗后的細胞及對照組細胞4℃過夜(或37℃孵育2 h)后在室溫放置2 h，0.01 mol/L PBS洗片3次，每次5 min，避光條件下加入熒光(FITC)標記羊抗兔IgG(熒光二抗,1∶50倍稀釋)，室溫放置2 h后用0.01 mol/L PBS洗片(避光條件下)3次，每次5 min。做好以上步驟后，將板子里放點PBS，保存片子濕潤，不要干片，以免影響細胞形態。到激光共聚焦觀察室后，再將爬片取出，在干凈的載玻片上滴1滴50%的甘油，然后將爬片取出來倒扣在滴過甘油的載玻片上，顯微鏡下觀察、拍照。

1.3RT-PCR 檢測 AQP1 mRNA的表達從前列腺癌PC3細胞系中提取總RNA,紫外分光光度計測定總 RNA純度并計算其濃度。應用RT試劑盒逆轉錄合成cDNA 。根據AQP1在GenBank中的cDNA全長序列，使用Primer Premier 5軟件設計引物，引物由上海生工生物工程公司合成。進入半定量PCR反應體系,AQP1引物序列：上游:5′-GAAATCCCAACTCCAAAGAG-3′ ;下游:5′-CAGCTAGACAATGATTTGGC-3′,擴增長度為251 bp;人β-actin引物:上游:5′-AGCGCAAGTA CTCCGTGTG-3′ ;下游:5′-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3′,擴增長度501 bp;PCR反應條件:95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,擴增30個循環。上下游引物分別用適量滅菌雙蒸水溶解至濃度為10 pmol/μl。 PCR反應體系為cDNA模板1 μl、AQP1上下游引物各0.5 μl、人β-actin上下游引物各0.2 μl。 PCR 產物在 2%瓊脂糖凝膠上電泳分析。

1.4siRNA載體構建及轉染構建的重組質粒經DNA測序技術證實重組質粒序列與所設計序列完全一致，表明針對AQP1基因的siRNA表達載體構建成功。構建好的CTD468-18超純質粒用脂質體法成功轉染前列腺癌PC-3細胞，轉染效率達40%。采用Western印跡法檢測各組細胞中AQP1蛋白的表達，結果2組細胞β-actin雜交帶亮度相似，在位于28 kD蛋白條帶位置均呈現AQP1特異性蛋白雜交條帶的表達，但亮度有明顯差異，其中轉染組細胞的蛋白條帶亮度明顯低于空白對照組。

1.5裸鼠的飼養及腫瘤細胞的種植本實驗所用裸鼠飼養于佳木斯大學動物實驗中心的小鼠飼養隔離器內,觀察小鼠的生長狀況。取轉染72 h的前列腺癌細胞及正常培養的前列腺癌細胞，胰酶消化收獲至離心管中，1 000 r/min，5 min，離心后去除培養液，如此反復 PBS 沖洗 3 次，以去除殘留的培養液，以苔盼藍法檢測細胞活率，檢測存活率90%以上后方可用于接種動物。用 PBS 將細胞調至密度 4×107/ml，重懸細胞并混勻，放入無菌 Eppendorf管，并用封口膠密封，置入冰盒待用。收集好的細胞最好在 30 min 內接種，以保證各組細胞活力。采用6周齡雄性裸鼠60只，隨機分為2組，每組30只，分別接種前列腺癌細胞及轉染后的前列腺癌細胞，碘伏溶液消毒穿刺點兩次。上下顛倒 Eppendorf 管以混勻細胞懸液，用注射器吸取細胞懸液。每只裸鼠皮下注射 200 μl，針頭與皮膚大約 10°~15°方向斜行刺入皮膚約1.0 cm，輕輕挑起皮膚后開始注射，以免刺入胸腹腔，注射完畢后，慢慢退出針頭，用無菌棉簽輕輕按壓穿刺點約 2 min，以防細胞懸液溢出。用碘伏溶液消毒穿刺點，以防感染。接種后，每天觀察裸鼠，觀察裸鼠及腫瘤生長情況，42 d后終止觀察處死裸鼠，小心完整剝離出皮下移植瘤。

1.6統計學分析采用SPSS13.0軟件行t檢驗及方差分析。

2結果

2.1AQP1在PC-3細胞的表達通過激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照分析及Western印跡蛋白檢測，證實AQP1在前列腺癌細胞表達，且主要表達于細胞膜及胞質。激光共聚焦顯微鏡顯示細胞膜及胞質被染成綠色，細胞核未著色(圖1A)。轉染24 h后熒光顯微鏡觀察： 熒光顯微鏡下，用紫外光激發，觀察細胞。未轉染的細胞不顯色，轉染細胞呈紅色熒光(圖1B)。

A：AQP1在前列腺癌PC-3 細胞中表達；B：熒光顯微鏡下siRNA轉染的PC-3細胞圖1　AQP1在PC-3細胞中的表達(×200)

2.2AQP1 mRNA在PC-3細胞的表達AQP1的RT-PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外透射儀下在300 bp左右可見明顯的特異產物帶，表明AQP1正常表達。同對照組相比(0.954±0.032)，轉染組表達減弱有統計學差異〔(0.610±0.060)，P<0.05〕。

2.3Western印跡檢測轉染后PC-3細胞中AQP1蛋白的表達兩組細胞β-actin雜交帶亮度相似，在位于28 kD蛋白條帶位置均呈現AQP1特異性蛋白雜交條帶的表達，但亮度有明顯差異，其中轉染組細胞的蛋白條帶亮度明顯低于對照組(圖2)。

1Marker:2正常前列腺癌PC-3細胞;3轉染后前列腺癌PC-3細胞圖2　Western印跡AQP1蛋白在正常前列腺癌PC-3細胞及轉染后細胞中的表達

2.4裸鼠皮下移植腫瘤體積及重量比較兩組裸鼠生命活動正常,無一死亡。與對照組相比，轉染組裸鼠移植瘤體積為(373.39±175.24)mm3明顯小于對照組(882.50±327.86)mm3(P=0.03)。轉染組腫瘤重量為(0.55±0.11)g 明顯小于對照組〔(1.31±0.29)g，P=0.027〕。

3討論

AQPs是家族性膜通道蛋白，能夠快速的介導水和一些小分子物質通過。AQPs廣泛分布于機體的組織和器官，不同的組織和器官有不同的AQP分布，有時是多種AQP分布于同一器官，有利于維護組織器官的生理功能〔5〕。AQPs除了生理情況下調節微環境維護器官的生理功能外，病理情況下特別是在腫瘤的發生發展機制中起了重要的作用〔6〕， AQPs在前列腺癌中的分布和作用的初步研究表明AQP1在前列腺癌組織中高表達，抑制AQP1的表達可以抑制PC-3細胞的遷移〔7〕。AQP1大量表達于腫瘤細胞膜或許能夠改變腫瘤上皮內的滲透壓，有助于腫瘤細胞體積及外形的改變，向周圍基質浸潤〔8〕。前期試驗表明〔4，9〕AQP1大量表達于前列腺癌組織中的腫瘤血管內皮細胞和腫瘤細胞的胞質內及胞膜上，其表達量較正常前列腺組織明顯增多，但是AQP1在前列腺癌PC-3細胞中的不同水平表達及對前列腺癌PC-3細胞的影響還不清楚。

在本次實驗中運用免疫組化和RT-PCR 在不同水平檢測了前列腺癌PC-3細胞中AQP1的表達，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，可見前列腺癌細胞薄膜及胞質被染成綠色，胞核未著色，證實AQP1主要表達于前列腺癌細胞膜和胞質。

RNAi是通過雙鏈RNA分子介導的序列特異性轉錄后使相關基因表達減少或不表達的過程，能夠使目標基因穩定沉默但對于正常基因的表達卻不造成影響〔10〕。本研究表明RNAi質粒載體的導入明顯抑制了前列腺癌PC-3細胞的AQP1蛋白表達。AQP1基因沉默組裸鼠的移植瘤生長速度及體積明顯小于對照組，表明干擾AQP1的表達能夠抑制腫瘤的發生發展。

綜上，AQP1高表達促進了腫瘤的發生發展，阻斷或者抑制AQP1的表達能夠抑制移植瘤的發展，靶向抑制AQP1可能為前列腺癌的基因治療提供依據。

4參考文獻

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin，2009；59(4):225-49.

2邵常霞，項永兵，劉振偉，等.上海市區泌尿系統惡性腫瘤相對生存率分析〔J〕.中國腫瘤臨床，2005；32(6):321-4.

3Beatrice Nico,Tiziana Annese,Roberto Tamma,etal.Aquaporin-4 expression in primary human central nervous system lymphomas correlates with tumour cell proliferation and phenotypic heterogeneity of the vessel wall〔J〕.Eur J Cancer,2011；22(10):1016-26.

4牛文斌，孔祥波，魏巍.前列腺癌中AQP123的表達和作用〔J〕.中國腫瘤臨床，2007;31(5)：441-3，446.

5Hwang I,Jung SI,Hwang EC,etal.Expression and localization of aquaporins in benign prostate hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Chonnam Med J,2012;48(3):178.

6馬永亮，張曉榮.RNA小片段干擾對前列腺癌細胞水通道蛋白-1的影響〔J〕.現代腫瘤醫學，2013;21(4)：731-3.

7Pan XY,Guo H,Han J,etal.Ginsenoside Rg3 attenuates cell migration via inhibition of aquaporin 1 expression in PC-3M prostate cancer cells〔J〕.Eur J Pharmacol,2012;683(1-3):27-34.

8譚美蕓.水通道AQP1的研究進展〔J〕.中國實用醫藥，2010;9(5)：241-3.

9牛文斌，王春玲，秦迎春.TSP1與AQP1在前列腺癌中的表達及與血管生成的關系〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(24)：3797-8.

10張勇，王振寧.RNA干擾技術及其在腫瘤研究領域的進展〔J〕.中國腫瘤防治雜志，2006;18(13)：1436-9.

〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R737.25

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1596-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.026

基金項目：黑龍江省衛生廳科研課題(2009-328)

1吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科

第一作者：牛文斌(1972-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事泌尿外科腫瘤研究。