AMPK腺病毒載體在小鼠骨骼肌中的表達和作用

劉　倩，胡　芳，牛文彥（天津醫科大學免疫學系，天津　300070）

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AMPK腺病毒載體在小鼠骨骼肌中的表達和作用

劉倩，胡芳，牛文彥
（天津醫科大學免疫學系，天津300070）

摘要目的：探討注射AMPK腺病毒在小鼠骨骼肌中的表達和作用。方法：C57BL/6小鼠隨機分為4組:（1）無任何處理的空白對照組。（2）肌肉注射腺病毒空載體（Ad-GFP）組。（3）肌肉注射Ad-GFP，48 h后腹腔注射AMPK激活劑AICAR組。（4）肌肉注射GFP標記的激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）組。注射腺病毒72 h后，處死小鼠，通過小動物成像系統測定骨骼肌中的熒光強度，檢測腺病毒的表達，用Western blot方法檢測ACC的磷酸化。結果：與空白對照組比較，注射腺病毒組的平均熒光強度顯著增高。與病毒空載體組比較，注射AICAR組和Ad-AMPK-CA組的ACC磷酸化水平顯著升高。結論：AMPK腺病毒能在小鼠骨骼肌中表達目的蛋白，調節AMPK的作用。

關鍵詞AMPK；腺病毒；小鼠；骨骼肌

Effect and expression of AMPK adenovirus on mouse skeletal muscle

LIU Qian,HU Fang,NIU Wen-yan
（Department of Immunology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Abstract Objective:To explore the effect and expression of injected AMPK adenovirus on mouse skeletal muscle.Methods:Ten weeks old C57BL/6 male mice were randomly divided into four groups.Mice in group1 were normal control group without treatment.Mice in group 2 were intramuscularly injected green fluorescence protein adenovirus(Ad-GFP).Mice in group 3 were intramuscularly injected Ad-GFP,after which were intraperitoneally injected AMPK activator AICAR in 48 h.Mice in group 4 were intramuscularly injected Ad-AMPK-CA.Seventy two hours after adenovirus treatment,all mice were executed and the expression of adenovirus was analysed in skeletal muscle.Fluorescence intensity and ACC phosphorylation in skeletal muscle were analysed by vivo imaging system and western blot,respectively.Results:Compared with the control group,the mean fluorescence intensity of the experimental groups which were injected adenovirus was significantly higher.Compared with the Ad-GFP group,ACC phosphorylation of AICAR and Ad-AMPK-CA groups were significantly increased.Conclusion:AMPK adenovirus can express the target protein in mouse skeletal muscle,and regulate the activity of AMPK.

Key words AMPK；adenovirus；mouse；skeletal muscle

2型糖尿病以葡萄糖代謝異常為特征，主要發病機制是胰島素抵抗[1-2]，肥胖是其主要誘因。通過非胰島素依賴機制促進外周組織對葡萄糖的攝取和脂肪酸的氧化是2型糖尿病治療的關鍵。單磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）是能量代謝和響應外部刺激的一個關鍵的調節器[3]。它是由一個催化亞基（α）和兩個調節亞基（β，γ）組成的異三聚體酶[4]。在營養缺乏和病毒感染時，升高胞內AMP / ATP比值和活化一些上游激酶來激活AMPK，導致α亞基中的蘇氨酸172的磷酸化增加，激活AMPK[5]。當AMPK被激活時，通過調節下游的信號通路，例如，AMPK直接磷酸化乙酰-CoA羧化酶（ACC）和HMG-CoA還原酶（HMGCR），能抑制合成代謝，并促進分解代謝，增加骨骼肌對葡萄糖的攝取，增強脂肪酸的氧化作用和胰島素的敏感性，因此AMPK及其信號通路已成為2型糖尿病的預防和治療的熱點。本研究通過在C57BL/6小鼠中注射激活型AMPK腺病毒，檢測腺病毒在小鼠體內的表達和作用，為進一步在體內研究AMPK信號通路奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料C57BL/6小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心,普通飼料購自美國Research Diets公司，HEK293β5細胞和AMPK激活型腺病毒重組質粒（Ad-AMPK-CA)由廈門大學林圣彩教授實驗室贈與，DMEM高糖購自美國Gibco公司，胎牛血清購自以色列Bioind公司，抗磷酸化ACC和GPADH抗體購于Cell Signaling Technology，試劑AICAR購自Enzo公司，增強化學發光底物檢測試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養HEK293β5細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，在37℃，5% CO2培養箱中培養。

1.2.2 AMPK腺病毒的包裝和擴增轉染前24 h，HEK293細胞接種在60 mm培養皿中，接種密度為50%～70%。5 μg鑒定好的重組病毒質粒通過Pac I單酶切處理。將單酶切線性化的重組腺病毒質粒用乙醇沉淀，離心棄上清。待乙醇揮發完全后，用10μL無菌水重懸質粒。處理過的質粒用Lipofectamine2000轉染到HEK293細胞中。轉染完8 h后換液，換液用10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。轉染后7～10 d，收集細胞，離心棄上清，加入2 mL 10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，重懸細胞。通過液氮/37℃反復凍融3次，讓病毒釋放，離心提取含腺病毒的上清。分裝保存于-80℃冰箱。在60 mm培養皿中接種HEK293細胞，細胞密度達70%，加入10 μL上述收集的腺病毒上清液，感染72 h后，可出現細胞變圓、破裂、漂浮的病變現象。當50%以上的細胞出現漂浮時，可沖勻收集細胞，液氮反復凍融3次。離心提取上清液，完成病毒擴增。用第一輪裂解的病毒上清液感染HEK293細胞即可得到第2輪的病毒。

1.2.3小鼠分組和處理SPF級6周齡雄性C57BL/6小鼠23只，用脂肪含量10%的普通飼料喂養小鼠，小鼠自由飲食飲水，飼養在溫度（22±2）℃、濕度（55±10）%、12 h照明/非照明循環房間。喂養至10周，體質量達（23.50±0.78)g，隨機分為4組:（1）無任何處理的空白對照組（3只）。（2）肌肉注射腺病毒空載體（Ad-GFP）對照組（5只）。（3）肌肉注射Ad-GFP，48 h后腹腔注射AMPK激活劑AICAR組（5只）。（4）肌肉注射GFP標記的激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）組（5只）。腺病毒注射量為110 μL/只，AICAR為150 mg/只。腺病毒注射72 h后處死小鼠，取骨骼肌肉。

1.2.4體內分布檢測用小動物成像系統對肌肉組織進行熒光定量分析，從而確定腺病毒在小鼠骨骼肌的表達。

1.2.5免疫印記檢測ACC的磷酸化裂解肌肉組織，將肌肉組織切成小塊移至冷的Eppendorf管中，用預冷的PBS緩沖液清洗肌肉組織2次。0.1 g肌肉組織中加入500 μL含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L Na3VO4，1 μmol/L PIC，200 μmol/L PMSF，0.5 mmol/L NaF）的組織裂解液，用超聲勻漿破碎機裂解組織樣品。預冷離心機至4℃，13 000 r/min離心10 min，收集上清，重復兩次。按照BCA Protein Assay Kit說明書來測定蛋白濃度，再與5×LSB緩沖液按4∶1的比例混合，65℃加熱15 min，7.5%（V/V）SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，轉到PVDF膜上，用3%牛血清蛋白封閉2 h，再分別用各自一抗4℃孵育過夜，二抗使用偶聯辣根過氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgM孵育2 h，蛋白條帶用增強化學發光法檢測，曝光膠片。用GAPDH作為內參，Image J軟件定量，即可檢測蛋白的磷酸化水平。

1.3統計學處理采用GraphPad Prism6統計軟件進行統計學分析，計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1細胞形態學改變顯微鏡下觀察正常HEK293細胞為多角形，觸角相連呈網狀貼壁生長。腺病毒感染HEK293細胞后，細胞變圓，觸角消失，部分細胞破碎漂浮，未脫落細胞有聚集融合（圖1）。

圖1　腺病毒載體感染細胞后形態改變Fig 1 Morphological changes in HEK293 cells infected with adenovirus

2.2 GFP熒光標記的腺病毒在骨骼肌中的檢測結果腺病毒質粒中帶有綠色熒光蛋白GFP，可以對腺病毒的感染表達進行追蹤觀察。收取小鼠骨骼肌肉組織，通過小動物活體成像系統，檢測肌肉中GFP標記的腺病毒的熒光強度，確定腺病毒感染到小鼠組織中。如圖2所示，以未注射病毒的小鼠組織為背景對照組，注射腺病毒實驗組的小鼠骨骼肌中能檢測出熒光強度，通過熒光定量分析與背景對照組比較有顯著差異（圖3），說明腺病毒已轉染到小鼠肌肉組織中。

2.3 Western blot檢測磷酸化ACC水平檢測了AMPK的下游ACC的磷酸化水平以判斷激活AMPK的效果，確保在小鼠體內發揮作用。如圖4所示，AICAR是AMPK的激活劑，與病毒空載體對照組比較，注射AICAR的實驗組磷酸化ACC水平升高，為對照組的（1.51±0.15）倍（P<0.01），注射Ad-AMPK-CA組的磷酸化ACC水平上升至對照組的（1.91±0.09）倍（P<0.001）。

圖2　GFP在骨骼肌中的表達Fig 2 Expression of green fluorescence protein in skeletal muscle

圖3　骨骼肌中熒光定量分析結果Fig 3 The mean fluorescence intensity in skeletal muscle

圖4　骨骼肌中磷酸化ACC蛋白的表達Fig 4 The phosphorylation of ACC in mouse skeletal muscle

3　討論

糖尿病已成為一個重大的公共健康問題，預計到2030年，其發病率將達到7.7%，患病人數將增加至4.39億[6]。2型糖尿病是其最常見的形式，其特征是胰島素抵抗，骨骼肌減少了對胰島素的敏感性是重要原因[7-8]。骨骼肌是利用葡萄糖的主要外周組織，AMPK的活化能促進骨骼肌攝取葡萄糖。AMPK是一個絲氨酸/蘇氨酸磷酸激酶，AMPK的α亞型具有催化活性。α1亞型廣泛表達，而α2亞型在肝臟、心臟和骨骼肌中高表達[9]。Thr172是AMPKα亞型的主要的磷酸化位點，其磷酸化是AMPK催化活性必不可少的。肌肉收縮和運動能激活AMPK[10]。本實驗中Ad-AMPK-CA突變位點在T142，而AMPK抗體檢測的磷酸化位點在Thr172，因此需要檢測AMPK下游蛋白的磷酸化水平判斷AMPK的活性。ACC是存在于胞液中的變構羧化酶，通過生物素羧化酶功能和羧基轉移酶功能催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸代謝的限速酶，是AMPK的下游分子[11-12]。激活AMPK進而使ACC磷酸化增加，活性降低。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）是細胞可滲透腺苷類似物，通過腺苷轉運蛋白能被細胞吸收，腺苷激酶快速磷酸化，形成5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷（ZMP），通過模擬放大作用增加AMPK的活性[13]，在體內和體外實驗中作為一種激活AMPK的工具。本實驗中，Ad-AMPK-CA和AICAR都顯著升高小鼠骨骼肌ACC的磷酸化水平，說明二者在小鼠體內發揮著增加AMPK活性的作用。

在基因工程中所運用的病毒載體是一種定向或非定向的載體，來源于病毒的DNA或者RNA基因組。RNA病毒的逆轉錄病毒載體中，應用廣泛的是慢病毒。慢病毒載體是指以HIV-1來源的一種病毒載體[14]，能夠感染多種難感染的細胞，比如原代細胞、干細胞、神經元細胞等。慢病毒能夠將外源基因插入細胞基因組內，實現穩定轉染，但是重組病毒的滴度不夠高，而且有導致基因突變的危險。DNA的病毒載體中，應用廣泛的是腺病毒和腺相關病毒。腺病毒相對穩定，可以長時間冷凍儲存而不失去感染能力，可以有效地轉染各種細胞類型和組織[15]，易于基因重組操作，繁殖滴度高，安全性好，發生插入突變率低。穿梭質粒中含有編碼GFP的序列，方便追蹤檢測[16]。本實驗中AMPK腺病毒和腺病毒空載體均含有GFP熒光蛋白，小動物活體成像采用熒光報告基團GFP進行標記，通過激發光激發熒光基團到達高能量狀態，而后產生發射光，通過后期的特有的軟件處理，有效地除去動物自身所發出的熒光信號，對肌肉組織進行定性和定量分析。通過小動物成像和熒光強度定量分析結果表明，AMPK腺病毒成功轉染至小鼠骨骼肌中。

綜上所述，肌肉多部位注射AMPK腺病毒能感染至小鼠骨骼肌中，并且能夠表達目的蛋白，調節AMPK的活性。AMPK腺病毒可作為一種實驗方法，用于AMPK的體內研究。

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（2015-08-16收稿）

關于醫學符號的使用

統計學符號不論用哪種字母，也不論大寫或小寫一律都用斜體。要注意區分拉丁字母和希臘字母。例如均數的符號是字母，卡方的符號是希臘字母χ2，自由度的符號是希臘文“υ”，不是拉丁文“V”。樣本的相關系數是英文“r”，不能誤為希臘文“γ”。

化學元素及核素在醫學寫作時一般多采用符號，都是拉丁字母正體大寫。離子態是在右上角用數字加“-”或“+”表示。例如Na+、Ca2+、P3-等等，不采用Ca++、P---、Al+3、O-2表示。核素的核子素（質量數）應寫在元素符號的左上角，例如131I、32P。表示激發狀態的m寫在右上角，例如：99Tcm、133Inm。在科技論文和專著中不應寫核素的中文名稱，即不能寫成131碘、133銦m等。

近幾年分子生物學發展很快，并已滲透到許多學科，大多數分子生物學名詞術語的符號已有統一的確定形式，要對符號的來源及其內涵有深刻的了解，使用時不致發生錯誤，例如：RNA有rRNA（ribosonal RNA）、tRNA（transfer RNA）、mRNA（messenger RNA）3類。r、t、m是表示類型的符號應小寫，RNA應大寫。

（編輯部）

作者簡介劉倩（1989-），女，碩士在讀，研究方向：免疫學；通信作者：牛文彥，E- mail：wniu@tijmu.edu.cn。

基金項目國家自然科學基金面上項目基金資助（81170740）；高等學校博士學科點專項基金（20121202110014）；天津市科委應用基礎研究重點項目（15JCZDJC35500）

文章編號1006－8147（2016）01-0001-04

中圖分類號R392.1

文獻標志碼A