復方呋塞米螺內酯膠囊質量控制方法的研究

上官可可，李美珍，楊金榮，房志仲（.天津醫科大學第二醫院藥劑科，天津　300；.天津醫科大學藥學院藥劑學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津　300070）

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復方呋塞米螺內酯膠囊質量控制方法的研究

上官可可1，李美珍2，楊金榮2，房志仲2
（1.天津醫科大學第二醫院藥劑科，天津300211；2.天津醫科大學藥學院藥劑學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

摘要目的：建立復方呋塞米螺內酯膠囊（FuSpirC）的質量控制方法。方法：用高效液相色譜法測定復方制劑中呋塞米和螺內酯的含量。結果：色譜柱：Kromasil C(18)柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀（67∶33）（0.85%磷酸調節pH 至4.3），流速0.8 mL/min，檢測波長為239 nm，呋塞米、螺內酯分別在5～35 μg/mL、20～80 μg/mL濃度范圍線性關系良好，呋塞米平均回收率分別為98.29%（RSD=0.08%，n=3）、99.20%（RSD=0.48%，n=3）、99.18%（RSD = 0.36%，n=3），螺內酯平均回收率分別為101.76%（RSD=0.13%，n=3）、101.35%（RSD=0.52%，n=3）、101.67%（RSD = 0.27%，n=3），平均回收率的RSD均小于2%，符合方法學要求，呋塞米、螺內酯平均含量分別為94.79%、99.76%，均符合要求。結論：所建立方法可用于復方呋塞米螺內酯膠囊的質量控制。

關鍵詞呋塞米；螺內酯；高效液相色譜法；質量控制

Study of the quality control of the compound furosemide and spironolactone capsules

SHANGGUAN Ke-ke1,LI Mei-zhen2,YANG Jin-rong2,FANG Zhi-zhong2
（1.Department of Pharmacy,The Second Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China；2.Department of Pharmacy,College of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics(Theranostics)，Tianjin 300070,China）

Abstract Objective:To develop a method for controlling the quality of compound FuSpirC.Methods:High performance liquid chromatography was used to determine the contents of furosemide and spironolactone in compound FuSpirC.Results:Column was represented by Kromasil-C18(200 mm×4.6 mm，5 μm),mobile phase was methanol:0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate(67:33)(used 0.85% phosphoric acid adjust pH 4.3),flow rate 0.8 mL/min,detected wavelength was 239 nm,the concentrations of furosemide and spironolactone were 5～35 μg/mL and 20～80 μg/mL,respectively,and were in good linear relationship.The average recovery rate of furosemide were 98.29%(RSD = 0.08%，n=3)，99.20%(RSD = 0.48%，n=3)，99.18%(RSD = 0.36%，n=3),while spironolactone were 101.76%(RSD = 0.13%，n=3)，101.35%（RSD = 0.52%，n=3），101.67%(RSD = 0.27%，n=3),the average recovery of RSD was less than 2%,conformed to the requirement of the methodology.The content of furosemide and spironolactone were 94.79% and 99.76%，conformed to the requirements.Conclusion:The methods can be used for quality control of compound FuSpirC.

Key words furosemide；spironolactone；HPLC；quality control

呋塞米為強效利尿劑，其作用機制主要是抑制腎小管髓袢升支粗段髓質部Na+、C1-的主動再吸收，因而尿中Na+、K+與水的排出增加而產生利尿作用[1]。此外，還有擴張腎小動脈的作用。長期或大劑量應用，可引起低鉀血癥、低鈉血癥和代謝性酸中毒。嚴重時因血容量降低，導致休克甚至死亡[2]。螺內酯為人工合成的類固醇類藥物，其結構與醛固酮類似，兩者在腎遠曲小管和集合管的皮質段起競爭作用，干擾醛固酮保鈉排鉀的作用，對伴有醛固酮增高的頑固水腫有治療作用，且可防止鉀的耗竭，在臨床上有重要用途[3]，對心力衰竭也有一定的療效[4]。單獨應用效力較弱，一般需與噻嗪類或呋塞米等合用，方可取得顯著利尿作用，并可抵消相互引起的低鉀血癥[5-6]。有研究顯示呋塞米螺內酯聯用可安全有效的治療輕中度原發性高血壓，有良好的耐受性，并且副作用小，不引起血糖、血脂代謝和血清中鉀、尿酸濃度的變化[7]。根據文獻，筆者研制該復方制劑膠囊，并建立相應質控方法。

1　材料和方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器高效液相色譜儀（美國Spectraphysics、Spectra Focus紫外檢測器、輸液泵、Anstar色譜工作站）；ZDY-Ⅱ-1 IKVA高精密度單相交流穩壓電源（國營啟東電訊廠）；pHS-25（數顯）pH計（Q/YXLG122，上海精密科學儀器有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ALC -210.4電子分析天平（ACCULAB Sartorius group，北京賽多利斯儀器系統有限公司）；U3310紫外可見分光光度計（Spectrophotometer Hitachi;High-Techrolgies Corporation）。

1.1.2試劑與藥品呋塞米標準品（中國藥品生物制品檢定所，100544-200501）；螺內酯標準品（中國藥品生物制品檢定所，100193-201102）；FuSpirC制劑（自制，3批）；甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；其它試劑均為市售分析純；重蒸水（自制）。

1.2方法[8]

1.2.1檢測波長以甲醇分別溶解呋塞米、螺內酯原料藥到適當濃度，按分光光度法在200～400 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，并掃描呋塞米螺內酯適當濃度的混合樣品，以確定檢測波長。

1.2.2色譜條件色譜柱為TIANHE誖Kromasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀=67∶33（用0.85%磷酸調節pH至4.3）；檢測波長：239 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

1.2.3專屬性試驗分別以流動相作溶劑，配制復方FuSpirc膠囊制劑溶液，呋塞米原料藥溶液、螺內酯原料藥溶液及空白輔料溶液。將所配溶液按照確定色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

1.2.4復方FuSpirC含量測定方法

1.2.4.1溶液的制備：（1）對照品溶液的制備：呋塞米標準儲備液的配制：精密稱取呋塞米標準品20 mg置于100 mL棕色量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，用甲醇稀釋定容，搖勻作為貯備液。螺內酯標準儲備液的配制：精密稱取螺內酯標準品50 mg置于50 mL量瓶中，用適量甲醇超聲溶解，用甲醇稀釋定容，搖勻作為貯備液。（2）樣品溶液的制備：取自制FuSpirC膠囊10粒，取出內容物，研細，精密稱取適量（相當于呋塞米20 mg、螺內酯50 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，冷卻，定容，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，備用。（3）空白對照液的制備：稱取處方中輔料，置量瓶中，以下操作同“1.2.4.1（2）”項下。

1.2.4.2標準曲線的制備：呋塞米標準曲線的繪制：分別精密量取“1.2.4.1項下”呋塞米儲備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和1.75 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，于色譜條件下進行測定。螺內酯標準曲線的繪制：分別精密量取“1.2.4.1項下”螺內酯儲備液0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70和0.80 mL置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，按照“1.2.2”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，做線性回歸。

1.2.4.3精密度試驗：取“1.2.4.1”溶液，按照“1.2.2”項下色譜條件平行進樣6次，分別計算呋塞米、螺內酯RSD值。

1.2.4.4穩定性試驗：精密稱取樣品，按照“1.2.4.1 （2）”項下方法操作，分別于0、3、6、9、12和24 h，按照“1.2.2”項下色譜條件進樣，計算RSD值。

1.2.4.5重復性試驗：分別量取供試品溶液6份，按照“1.2.4.1（2）”項下操作，按照“1.2.2”項下色譜條件，各取20 μL進樣，測定峰面積。

1.2.4.6回收率試驗：呋塞米回收率試驗：取空白輔料70 mg，置于50 mL棕色量瓶中，分別按照80%、100%和120%的量，加入呋塞米標準品4、5和6 mg，加適量甲醇超聲10 min，放冷至室溫，甲醇稀釋定容，搖勻，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，進樣測定。螺內酯回收率試驗：取空白輔料62.5 mg，置于50 mL量瓶中，分別按照80%、100%、120%的量，加入螺內酯標準品10、12.5、15 mg，加適量甲醇超聲使溶解，甲醇稀釋定容，搖勻，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，按照“1.2.2”項下色譜條件進樣測定。

1.2.4.7含量測定：取10粒膠囊，傾出內容物，研細稱取適量（相當于呋塞米5 mg、螺內酯12.5 mg）3份，分別置于50mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲10min，放冷至室溫，加甲醇稀釋定容，搖勻，取適量離心，精密吸取上清液1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，用流動相稀釋定容，搖勻，按照“1.2.2”項下色譜條件進樣測定。

2　結果

2.1檢測波長的選擇呋塞米甲醇溶液、螺內酯甲醇溶液、呋塞米螺內酯（FL）混合樣甲醇溶液分別做紫外全波長掃描，記錄吸光度圖譜，見圖1。呋塞米、螺內酯在239 nm左右處均有最大吸收波長，故選擇239 nm作為HPLC檢測波長。

2.2專屬性試驗結果呋塞米的保留時間為4 min，螺內酯保留時間為13 min，空白對照液色譜圖中與對照品相同保留時間處無干擾，表明輔料不干擾樣品測定。見圖2～5。

2.3線性關系考察結果呋塞米在5～35 μg/mL范圍內與峰面積成良好線性關系。其標準曲線方程為：y=41 286x+20 838，r=0.999 9(n=7)；螺內酯在20～80 μg/mL范圍內與峰面積成良好線性關系。其標準曲線方程為：y=69 185x-29 778，r=0.999 7（n=7）。

圖1　溶液200～400 nm波長紫外掃描結果Fig 1 UV spectrum of solutions(200～400 nm)

圖2　呋塞米原料藥HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of furosemide

圖3　螺內酯原料藥HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of spironolactone

圖4　復方FuSpirC膠囊HPLC色譜圖Fig 4 HPLC chromatograms of compound FuSpirC

圖5　空白輔料HPLC色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms of blank excipients

2.4精密度試驗結果呋塞米、螺內酯RSD分別為0.46%、0.34%，均RSD<2%，表明該測定方法精密度良好。

2.5穩定性試驗結果呋塞米、螺內酯RSD分別為1.03%、0.89%，均RSD<2%。實驗結果表明，供試品溶液在24 h內穩定，能滿足試驗要求。

2.6重復性試驗結果供試品中呋塞米含量RSD 為0.56%；螺內酯含量RSD為0.48%，本試驗重復性較好。

2.7回收率試驗結果呋塞米平均回收率分別為98.29%（RSD=0.08%，n=3），99.20%（RSD=0.48%，n=3），99.18%（RSD=0.36%，n=3）；螺內酯平均回收率分別為101.76%（RSD =0.13%，n =3），101.35% （RSD=0.52%，n=3），101.67%（RSD=0.27%，n=3），平均回收率的相對標準偏差均小于2%，符合方法學要求。見表1、2。

表1　呋塞米回收率測定結果Tab 1 Recovery test on furosemide

表2　螺內酯回收率結果Tab 2 Recovery test on spironolactone

2.8含量測定結果呋塞米平均含量為94.79%，在90%～110%范圍，符合《中國藥典》2010版（二部）中對呋塞米的質量要求，其RSD為0.78%，小于2%，符合質量標準規定；螺內酯平均含量為99.76%，在97%～103%范圍，符合《中國藥典》2010版（二部）中對螺內酯的質量要求，其RSD為0.66%，小于2%，符合質量標準規定。見表3～4。

表3　呋塞米含量測定結果Tab 3 The content of furosemide in FuSpirC

表4　螺內酯含量測定結果Tab 4 The content of spironolactone in FuSpir

3　討論

《中國藥典》2010年版（二部）中對呋塞米的含量測定為滴定法，螺內酯的含量測定選用的色譜條件為乙腈-水（50∶50）[9-10]，當選用乙腈-水（50∶50）為流動相時，呋塞米與螺內酯分離度差。有文獻報道采用甲醇-水（70∶30）[11]、0.02 mol/L磷酸氫二銨-乙腈（45∶55）[12]為流動相測定螺內酯，但用此2種流動相時螺內酯與呋塞米分離度均不佳，調節比例后仍然未見改善。另有相關文獻報道呋塞米含量測定以甲醇-水-磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀13.6 g加水80 mL使溶解，用磷酸調節pH值至3.0，用水稀釋至1 000 mL）（500∶493∶7）為流動相，但此流動相在試驗過程中呋塞米、螺內酯出峰時間較晚。調節流動相比例、流速，當甲醇-水-磷酸鹽緩沖液比例為670∶300∶30，流速為0.8 mL/min時，呋塞米、螺內酯出峰時間適中且峰形良好，但發現流動相在放置過程中有磷酸鹽析出。為使流動相配制簡便，調整流動相為甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀，調節其比例至67∶33，流速為0.8 mL/min時，螺內酯峰形不佳，用0.85%磷酸調節流動相pH至4.3時，峰形良好，塔板數和分離度均符合要求，故最終確定流動相為甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀（0.85%磷酸調節pH至4.3），流速為0.8 mL/min。

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（2015-07-29收稿）

綜述

作者簡介上官可可（1989-），男，碩士在讀，研究方向：臨床藥理學；通信作者：房志仲，E- mail:fangzhizhong@tmu.edu.cn。

文章編號1006－8147（2016）01-0080-04

中圖分類號R927.2

文獻標志碼A