矮牽牛多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)與快速鑒定

陳 一，李春楠

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310016）

文獻(xiàn)著錄格式：陳一，李春楠.矮牽牛多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)與快速鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（3）：361-363.

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矮牽牛多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)與快速鑒定

陳 一，李春楠

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310016）

文獻(xiàn)著錄格式：陳一，李春楠.矮牽牛多倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)與快速鑒定［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（3）：361-363.

摘 要：用不同濃度的秋水仙素溶液處理矮牽牛種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B3種子經(jīng)秋水仙素處理后出苗率普遍下降，從存活率上來(lái)看，以0.10％濃度處理的種子存活率較高，達(dá)到45％以上，在誘導(dǎo)率上各處理隨秋水仙素濃度增加略有上升，但差異不明顯，結(jié)合出苗率、存活率與誘導(dǎo)率，以0.10％秋水仙素處理48 h的效果最佳。流式細(xì)胞儀鑒定矮牽牛倍性準(zhǔn)確率達(dá)96.7％，不僅省時(shí)、高效，而且還可以快速、直觀地檢測(cè)出非整倍體，可以用于矮牽牛植株的早期快速倍性鑒定。

關(guān)鍵詞：矮牽牛；秋水仙素；流式細(xì)胞儀

矮牽牛（Petunia hybrida Vi1m.）原產(chǎn)南美，屬茄科，矮牽牛屬。因其花大、色彩豐富和花期長(zhǎng)等特點(diǎn)而應(yīng)用廣泛，素有“花壇之王”的美譽(yù)［1］。自1803年Jusseau確定了矮牽牛屬以來(lái)，已確定的矮牽牛大約30種。商業(yè)上常根據(jù)花的大小以及重瓣性將矮牽牛分為大花單瓣類、豐花單瓣類、多花單瓣類、大花重瓣類、重瓣豐花類、重瓣多花類和其他類型（不屬于以上類型的均歸為其他類型）。20世紀(jì)80年代后期，我國(guó)沿海地區(qū)分別從美國(guó)、日本和荷蘭等國(guó)大量引進(jìn)栽培，遍布全國(guó)各地。目前，市場(chǎng)上對(duì)矮牽牛的需求量越來(lái)越大，杭州市矮牽牛年用量在2 000萬(wàn)盆左右，是重要的花壇草花之一。

矮牽牛目前國(guó)內(nèi)外普遍栽培的類型有二倍體及四倍體2種倍性［2］。一般二倍體花10 cm以下，而四倍體大花單瓣型花徑達(dá)10～15 cm，且花期長(zhǎng)，花色豐富，是觀賞價(jià)值較高的盆栽花卉。20世紀(jì)50年代初，日本、美國(guó)等國(guó)家先后人工誘導(dǎo)矮牽牛多倍體獲得成功，并培育出許多優(yōu)美的多倍體類型新品種。秋水仙素是多倍體誘導(dǎo)的有效試劑，為了明確秋水仙素誘導(dǎo)矮牽牛種子適宜的濃度和處理時(shí)間，本試驗(yàn)對(duì)秋水仙素處理矮牽牛種子的發(fā)芽率和存活率做了統(tǒng)計(jì)。DNA流式細(xì)胞儀測(cè)定法是運(yùn)用流式細(xì)胞儀直接測(cè)定細(xì)胞的DNA含量，從而快速鑒定出植株倍性水平。目前，已被成功地用于甘藍(lán)類［3］、大白菜［4］、青花菜［5］、非洲菊［6］等植株的倍性鑒定上。本試驗(yàn)以矮牽牛為材料，采用DNA流式細(xì)胞儀測(cè)定法對(duì)植株進(jìn)行了快速鑒定，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，以期為矮牽牛染色體倍性的早期鑒定提供一種快速、簡(jiǎn)易、實(shí)用而又可靠的批量檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所矮牽牛高代自交系B3。

1.2多倍體誘導(dǎo)方法

處理方法為種子浸漬法，在培養(yǎng)皿中用秋水仙素水溶液浸泡種子，處理采用0.1％，0.2％，0.3％ 3個(gè)濃度梯度，24，48和72 h 3個(gè)時(shí)間梯度，處理溫度為20℃，每個(gè)處理種子數(shù)量為200粒，取出水洗后，再用蒸餾水浸沒24 h，播種于200孔穴盤中，對(duì)照采用蒸餾水浸種72 h。

1.3多倍體鑒定方法

用美國(guó)Beckman Cou1ter公司生產(chǎn)的DNA流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析鑒定。以誘導(dǎo)存活的B3矮牽牛各處理播種苗為材料，切取0.5 cm2嫩葉置培養(yǎng)皿中，加入萃取裂解緩沖液，快速切碎并使碎片完全浸于萃取液中，避光靜置萃取2～5 min，再加染色緩沖液快速混勻，避光靜置5～8 min，后過(guò)濾到樣品管內(nèi)獲得單細(xì)胞懸浮液。將樣品管插入分析儀，約20 s后分析儀自動(dòng)形成代表該樣品倍性的DNA含量峰值圖。以用根尖染色法鑒定倍性為二倍體（2n =14）B3矮牽牛植株作對(duì)照，每個(gè)處理測(cè)定30株樣品，重復(fù)2次。隨后抽取經(jīng)DNA流式細(xì)胞儀倍性鑒定的植株材料30株，用根尖染色體計(jì)數(shù)倍性鑒定法進(jìn)行跟蹤分析，分析DNA流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

多倍體誘導(dǎo)處理后在育苗溫室播種放置，一對(duì)真葉期時(shí)統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)，計(jì)算出苗率，移栽期時(shí)統(tǒng)計(jì)存活數(shù)，計(jì)算存活率。統(tǒng)計(jì)流式細(xì)胞儀鑒定的矮牽牛倍性，計(jì)算誘導(dǎo)率。

2　結(jié)果與分析

2.1多倍體誘導(dǎo)處理

如表1所示，各處理與對(duì)照相比出苗率都有降低。除對(duì)照的出苗率達(dá)84.0％以外，以0.3％秋水仙素處理72 h的出苗率最高，達(dá)71.5％，0.1％秋水仙素處理72 h的出苗率最低，為56.0％。其他各處理的出苗率差異不大，說(shuō)明不同秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)矮牽牛B3種子的出苗率影響不大。從存活率的結(jié)果來(lái)看，0.1％秋水仙素的3個(gè)不同處理時(shí)間下存活率較為接近，在50％左右，其中以48 h處理的存活率最高，達(dá)51.5％；0.2％秋水仙素的3個(gè)時(shí)間處理的存活率分別為43.0％，33.0％和35.0％，均低于0.1％秋水仙素處理；0.3％秋水仙素的3個(gè)時(shí)間處理的存活率更低，分別為20.5％，23.5％和24.5％。說(shuō)明不同濃度秋水仙素處理對(duì)矮牽牛B3種子的存活率有較大的負(fù)作用；在3個(gè)不同濃度的處理中，秋水仙素的濃度越高，B3種子的存活率越低，同樣濃度的不同處理時(shí)間之間B3種子的存活率差別不大，說(shuō)明秋水仙素的處理時(shí)間不是B3種子存活率的主要影響因素。

2.2多倍體鑒定結(jié)果

對(duì)B3的植株染色體倍性鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2所示，分離峰示例如圖1所示。隨機(jī)抽取經(jīng)DNA流式細(xì)胞儀倍性鑒定的植株材料30株，用根尖染色體計(jì)數(shù)倍性鑒定法進(jìn)行跟蹤分析，其中29株與DNA流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果一致。說(shuō)明流式細(xì)胞儀測(cè)定法的倍性鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到96.7％。從表2可以看出，隨著處理濃度的提高，誘導(dǎo)率略有上升，其中0.3％秋水仙素處理24 h的誘導(dǎo)率最高，達(dá)30.0％，不同處理時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)率的影響不大。

表2　秋水仙素對(duì)矮牽牛B3誘導(dǎo)率的影響

圖1　不同倍性矮牽牛流式細(xì)胞儀測(cè)定的分離峰

在發(fā)生誘導(dǎo)的矮牽牛流式細(xì)胞儀分離峰圖中，有約1/5的樣品與對(duì)照呈倍性關(guān)系（圖1），但大部分誘導(dǎo)植株不呈倍性關(guān)系，說(shuō)明在誘導(dǎo)過(guò)程中加倍植株不同倍性細(xì)胞嵌合產(chǎn)生了混倍體。

3　討論

試驗(yàn)證明，用秋水仙素水溶液浸漬矮牽牛種子誘導(dǎo)多倍體較易獲得成功，但秋水仙素的濃度對(duì)矮牽牛種子的發(fā)芽與存活有較強(qiáng)的抑制作用，結(jié)合出苗率、存活率與誘導(dǎo)率來(lái)看，以0.1％秋水仙素處理48 h的效果最好，其存活率達(dá)51.5％，為各處理最高，誘導(dǎo)率也達(dá)到26.7％。

混倍現(xiàn)象是多倍體誘變中經(jīng)常出現(xiàn)的現(xiàn)象，在本試驗(yàn)中也得到了證實(shí)。誘變種子或幼苗頂端分生組織細(xì)胞都是多層細(xì)胞，被誘變加倍的可能性不同，也有多倍與未加倍細(xì)胞同時(shí)存在同一個(gè)體中生長(zhǎng)發(fā)育，因而形成植株的混倍現(xiàn)象。DNA流式細(xì)胞儀測(cè)定法測(cè)定出單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量，且其DNA含量變異可在分布圖上直觀地看出。測(cè)定取

作者簡(jiǎn)介：陳 一（1982—），男，農(nóng)藝師，從事花卉育種工作，E-mai1：chenyi17@126.com。

基金項(xiàng)目：杭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20130932H04）

收稿日期：2015-10-25

中圖分類號(hào)：S681.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0528-9017（2016）03-0361-03

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160321