Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中microRNA表達譜的初步研究

張新橋，王　紅

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·實驗論著·

Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中microRNA表達譜的初步研究

張新橋，王紅

Preliminary research on plasma microRNA profiling in patients with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome

Xin-Qiao Zhang, Hong Wang

Foundation item:Natural Science Foundation of Bejing (No.7122042)

Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Lab，Beijing Tongren Eye Center，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China

Correspondence to:Hong Wang. Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Lab，Beijing Tongren Eye Center，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China. wanghongyk@sina.com

Received：2016-01-12Accepted：2016-03-15

Abstract

?AIM:To explore the differences of expression pattern of microRNA(miRNA) in plasma from Vogt-Koyanagi-Harada(VKH) syndrome patients and normal controls, searching for diseases-relating biomarkers.

?METHODS:Blood samples from 10 cases of VKH patients and 10 cases of normal control were collected to extracted total RNA in plasma. The cDNA was synthesized by reverse transcription, and then underwent real time PCR in a 96 well plate from miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR panels .Original Ct value was obtained. The Exiqon GenEx qPCR analysis software was used to analyse the original data and the differential miRNAs was obtained and analyzed by bioinformatics.

?RESULTS:The panels contained 179 miRNAs classes from human individuals. In comparison with the healthy controls，there were 20 differential miRNAs, in which 12 miRNAs were up regulated and 8 miRNA were down regulated(allP<0.05). These microRNAs participated in the regulation of various signaling pathways.

?CONCLUSION:The VKH patients and healthy controls have significantly different expression profiles of microRNA．The differential expression of microRNA may be involved in the pathogenesis of VKH.

KEYWORDS:?Vogt-Koyanagi-Harada sydrome;microRNA;plasma;profiling

Citation:Zhang XQ, Wang H.Preliminary research on plasma microRNA profiling in patients with Vogt-Koyanagi-Harada syndrome.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):625-629

摘要

關鍵詞：Vogt-小柳原田綜合征；microRNA；血漿；表達差異

引用：張新橋，王紅.Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中microRNA表達譜的初步研究.國際眼科雜志2016;16(4):625-629

0引言

Vogt-小柳原田綜合征(Vogt-Koyanagi-Harada，VKH)是一種累積全身多系統的自身免疫性疾病，主要以雙側肉芽腫性全葡萄膜炎為特征，常伴有聽力障礙、腦膜刺激征、毛發變白或脫落、白癜風[1]，是國內最常見的葡萄膜炎類型之一，其發病快、進展快、反復發作、致盲率高[2]。截至目前，有關VKH的病因與發病機制尚不完全清楚[3]。microRNA(簡稱miRNA)是一類新發現、短序列、非編碼的小分子RNA，參與基因組轉錄后水平的調節。miRNA在轉錄后水平通過與mRNA不完全結合調控基因表達，從而在真核生物基因調控過程中起到重要的作用[4]，截至目前有超過1 000個人類微小RNA調控人類約1/3的基因表達。miRNA參與固有和適應免疫應答，有越來越多的證據提示miRNA能夠成為VKH患者新的生物標記物以及治療的靶點，但miRNAs在VKH發生發展過程中的確切作用迄今尚不明確。因此本文應用miRNAs PCR芯片技術檢測VKH患者與正常人群的miRNAs差異表達譜，從而探討miRNAs在VKH發病中的意義。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與設備miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR芯片及配套試劑，丹麥Exiqon公司；miRNA抽提試劑The miRCURYTMRNA Isolation Kit提取總RNA，丹麥Exiqon公司。美國Bio-Rad iQ5 實時定量PCR儀。

1.1.2實驗對象選取10例發病期Vogt-小柳原田綜合征患者，排除其他免疫性疾病及全身其他系統疾病，VKH診斷標準采取國際公認診斷標準。對照組選取體檢中心體檢正常人群10例。所有人員均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿標本收集與miRNA提取應用EDTA-K2抗凝管采集靜脈血8mL，3000r/min離心10min，將上層血漿分裝至離心管中。 應用The miRCURYTMRNA Isolation Kit血漿miRNA抽提試劑，抽提總miRNA。

1.2.2 RNA質量檢測為了確認RNA提取效果，RNA提取時加入MS2 RNA(Roche，10165948001，937.5ng)，通過OD值測定計算回收率，根據檢測結果選取回收率>50%樣本。另外在RNA提取時加入RNA Spike-in kit(Exiqon，E23203)中的control RNA UniSp2、UniSp4、UniSp5 spike-in Template，在 microRNA QC PCR Panel(Exiqon，E203887)中檢測提取質量。

1.2.3 PCR芯片檢測與分析根據Exiqon公司提供的標準操作流程進行cDNA合成和實時定量PCR，利用配套軟件Exiqon GenEx qPCR analysis software對VKH組與健康對照組miRNA進行差異分析，采用t檢驗取P<0.05及差異倍數>2或<0.5為差異有統計學意義。

1.2.4生物信息學分析通過搜索TargetScan，Miranda數據庫得到差異miRNA調控的所有靶基因；隨后通過對差異miRNA對應靶基因進行GO顯著性功能分析，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的GO功能集以及對應的靶基因；同樣為了進一步闡明異常表達的miRNA參與的信號通路，我們對差異miRNA對應的靶基因進行KEGG Pathway顯著性分析，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的KEGG Pathway以及對應的靶基因；隨后通過對靶基因的顯著性GO功能集分析和顯著性Pathway分析，將GO和Pathway所包含的靶基因取交集；最后根據以上步驟得到的靶基因構建差異miRNA與靶基因的調控網絡，得到網絡中起核心調控作用的miRNA和被miRNA調控的關鍵靶基因。

2結果

2.1分光光度計檢測結果分光光度計檢測樣品液量為50μL，檢測樣品濃度11.8～18.5ng/μL不等，RNA總量為590～925ng不等，回收率59%～92.5%不等，均>50%，可取。

2.2 microRNA QC PCR Panel檢測結果QC PCR Panel中包括多數組織中穩定表達的hsa-miR-103、hsa-miR-191、hsa-miR-23a；在紅細胞中特異的hsa-miR-451(用于判定血漿樣品的溶血情況)；以及在RNA提取時添加的合成RNAUniSp2、UniSp4、UniSp5(用于判定RNA提取效率)。經檢測所有樣本hsa-miR-103、hsa-miR-191、hsa-miR-23a均穩定表達；各樣品ΔCq(miR-23a～miR-451a)差異在7以內，符合樣品無溶血的判定標準；各樣品間UniSp2、UniSp4、UniSp5差異均在3以內，符合樣品判定標準。

表1VKH患者血漿中差異表達的miRNA

miRNAP倍數上調miRNA Hsa-miR-424-5p0.0025.4 Hsa-miR-106b-3p0.0024.2 Hsa-miR-629-5p0.00034.5 Hsa-miR-133a-3p0.00045.2 Hsa-miR-130b-3p0.00045.2 Hsa-miR-200c-3p0.0016.2 Hsa-miR-376a-3p0.0054.9 Hsa-miR-376c-3p0.0078.1 Hsa-miR-374a-5p0.019.9 Hsa-miR-126-5p0.026.6 Hsa-miR-33a-5p0.033.4 Hsa-miR-10b-5p0.045.2下調miRNA Hsa-miR-324-3p0.0020.32 Hsa-miR-365a-3p0.0010.20 Hsa-miR-423-5p0.010.41 Hsa-miR-382-5p0.00050.34 Hsa-miR-584-5p0.0020.22 Hsa-miR-877-5p0.0070.19 Hsa-miR-93-5p0.020.49 Hsa-miR-146a-5p0.030.24

表220個異常表達的microRNA預測的靶基因數量

MicroRNA預測靶基因數模型hsa-miR-106b-3p174uphsa-miR-10b-5p261uphsa-miR-126-5p25uphsa-miR-130b-3p617uphsa-miR-133a-3p620uphsa-miR-200c-3p466uphsa-miR-33a-5p387uphsa-miR-374a-5p648uphsa-miR-376c-3p238uphsa-miR-424-5p1212uphsa-miR-629-5p184uphsa-miR-146a-5p213downhsa-miR-324-3p326downhsa-miR-365a-3p119downhsa-miR-382-5p206downhsa-miR-423-5p174downhsa-miR-584-5p142downhsa-miR-877-5p115downhsa-miR-93-5p1174down

2.3 VKH患者血漿差異表達的miRNA經檢測發現VKH患者與正常對照相比有12個miRNA表達上調，有8個miRNA表達下調(表1)。

圖1上調microRNA靶基因顯著性的GO分析結果。

圖2下調microRNA靶基因顯著性的GO分析結果。

2.4差異表達的miRNA潛在靶基因生物信息學分析20個異常表達的microRNA在TargetScan，Miranda數據庫中共同的預測靶基因共得到7 415個，其中表達上調microRNA中靶基因最多的為sa-miR-424-5p靶基因數量最多，靶基因預測數量最少的為hsa-miR-126-5p；表達下調的microRNA中靶基因預測數量最多的為hsa-miR-93-5p，最少的為hsa-miR-877-5p(表2)。

2.5差異表達的microRNA的GO及KEGG分析結果基于Gene Ontology數據庫對差異表達microRNA進行GO顯著性分析，得到具有顯著性、低誤判率、靶向性的GO功能集以及對應的靶基因；基于KEGG數據庫對差異表達的microRNA進行KEGG Pathway顯著性分析，篩選GO、KEGG顯著性的標準是P<0.001，而假陽性率<0.05。

Vogt-小柳原田綜合征是一種自身免疫性疾病，那么我們根據圖1～2排除不相關的基因功能如神經發育、神經傳導后發現，差異表達的miRNA的顯著功能分析結果主要包括細胞分化、細胞周期、信號傳導等。根據圖3得出上調miRNA具有顯著性的信號傳導通路包括TGF-β通路、Wnt信號通路、MAPK信號通路、T細胞信號通路、P53信號通路等；如圖4得出下調miRNA具有顯著性的信號傳導通路主要包括MAPK信號通路、TGF-β通路、mTOR信號通路、Wnt信號通路、TNF信號通路等。通過圖5差異表達miRNA與靶基因調控網絡圖，可以得出處于核心位置的miRNA與靶基因，其中miR-106b、miR-130b等處于較為核心位置。

圖3上調microRNA調控的顯著性信號通路分析。

圖4下調microRNA調控的顯著性信號通路分析。

3討論

圖5上調和下調microRNA與靶基因的調控網絡。

microRNA是一類新發現的、約22個核苷酸長度的單鏈RNA，在動植物轉錄后水平參與基因表達調控，miRNA通過與靶分子mRNA堿基配對降解mRNA或阻礙其翻譯[4]。有研究表明miRNA在免疫細胞中廣泛表達，并影響免疫反應的各個階段；miRNA在免疫系統性疾病發病中起重要作用[5]。一系列研究表明，miRNA在免疫系統中發揮著重要的調節作用，能調控多種免疫過程，包括粒細胞發育、T和B細胞的成熟與分化、抗原遞呈過程、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)的信號級聯、細胞因子的產生和T細胞受體信號等[6]。循環miRNA可豐富而穩定地存在于體液中，因此在疾病狀態下，循環miRNA的表達譜有特征性的改變，因此循環中miRNA可作為一種無創傷性生物標志物，有助于疾病的預測、診斷和預后。研究表面特異表達的miRNA可能與自身免疫性葡萄膜炎的發病有關。Guo[7]應用微陣列芯片技術發現實驗性自身免疫性葡萄膜炎小鼠與正常小鼠相比PBMCs有36個miRNAs上調、31個miRNAs下調，且應用生物信息分析發現這些miRNAs可能通過T細胞受體信號通路、B細胞信號通路、Toll受體信號通路等免疫信號通路參與發病。Qi[8]發現活動期Behcet病患者CD4+T細胞中miR-23b顯著低表達，進一步研究發現轉染了miR-23b的CD4+T中Notch受體胞內區(Notch intracellular domain，NICD)被抑制以及炎癥因子IL-17、IFN-γ呈顯著低表達，則Behcet病患者低表達的miR-23b能夠激活Notch信號途徑并進而促進Th17細胞分化。

本研究應用PCR芯片技術檢測VKH患者血漿中miRNA表達譜，與正常對照相比有12個miRNAs上調，有8個miRNAs下調。有研究發現[9]，miR-424-5p參與肝細胞癌的轉移與發展。Jingushi[10]研究發現mi-629通過TGF-β信號通路加速腎細胞癌的發展，而本實驗中上調和下調表達的miRNA均部分通過TGF-β信號通路影響VKH的發病。有研究表明[11]，miR-106b通過影響上皮細胞自噬功能參與炎癥性腸道疾病的發病。De Santis[12]發現miR-106b通過調控TGF-β信號通路參與多發性硬化的發病，而提示本研究中異常表達的miR-106b抑或通過某種途徑調控TGF-β信號通路而影響VKH的發病。Wang[13]應用微陣列芯片等技術發現上調表達的miR-130b-3p與早期狼瘡性腎炎的蛋白尿量與上皮間質轉化有關，提示miR-130b-3p參與早期狼瘡性腎炎患者的發病與發展，提示我們異常表達miR-130b-3p亦或通過某種途徑參與VKH發病。miR-126通過核轉錄KappaB信號通路參與炎癥性腸道疾病的發病[11]，又有文章提示miR-126參與系統性紅斑狼瘡的發病[14]，這亦提示我們miR-126參與多種自身免疫性疾病的發病，也就證實本文中VKH患者血漿中異常表達的miR-126通過某種途徑參與其發病。miR-93通過抑制Th17細胞的分化參與多種自身免疫疾病的發生、發展，而Th17細胞已被證實參與小柳原田綜合癥的發病[15]。Watanabe[16]研究發現，自身免疫性葡萄膜視網膜炎小鼠模型的視網膜中阻止miR-146a表達水平升高，且與疾病的臨床表現程度評分以及IL-1/MCP-1比例呈正相關，而本文miR-146a在VKH患者血漿中表達水平降低可能與miRNA的組織特異性以及發病機制不同有關；類風濕關節炎[17]、系統性紅斑狼瘡[18]患者miR-146a均有不同程度的表達水平降低，通過某種機制參與其發病。

Vogt-小柳原田綜合征的具體發病機制尚不明確，miRNA與VKH發病的關系亦不清楚，miRNA已被證實參與多種疾病如癌癥、自身免疫疾病的發病，本文應用Exiqon公司的PCR芯片篩選出VKH患者與健康人差異的miRNA表達譜，通過生物信息分析得出差異表達miRNAs可能通過TGF-β等通路參與發病。本研究為進一步研究VKH的發病提供了依據， 但差異表達 miRNA 的調控機制尚不明確，仍需進一步研究。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.09

收稿日期：2016-01-12 修回日期： 2016-03-15

通訊作者：王紅，畢業于中山大學眼科中心，博士，主任醫師，研究方向：葡萄膜炎學.wanghongyk@sina.com

作者簡介：張新橋，在讀碩士研究生，研究方向：眼科學。

基金項目：北京市自然科學基金(No.7122042)
作者單位：(100730)中國北京市，首都醫科大學附屬北京同仁醫院 北京同仁眼科中心 北京市眼科學與視覺科學重點實驗室

目的：檢測Vogt-小柳原田綜合征(VKH)患者和正常對照人群血漿中miRNAs差異表達譜，探討miRNAs在VKH發病中的作用，尋找疾病相關的血漿生物標記物。

方法：采集10例VKH患者和10例正常對照組的血液樣本，提取血漿中的總RNA，先進行RNA逆轉錄合成cDNA，然后在96孔板中利用miRNA實時定量PCR芯片進行Real-time PCR擴增和溶解曲線分析。獲得原始的Ct值，應用Exiqon GenEx qPCR analysis software分析原始數據獲得差異表達miRNA，并對差異表達miRNA進行生物信息學分析。

結果：miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR芯片一共有179個人類來源的miRNAs，共篩選出20個差異表達的miRNAs，其中在VKH組中高表達者有12個，低表達者有8個。差異表達miRNAs參與多種信號通路。

結論：Vogt-小柳原田綜合征患者血漿中存在多個microRNA異常表達，異常表達的miRNAs可能通過某種信號通路參與VKH的發病。