TNF-a基因結構和功能生物信息學預測1*

于欣楊震楚元奎于美玲張怡清

1.寧夏醫科大學臨床醫學院醫學檢驗系 寧夏銀川 750004；2.寧夏醫科大學臨床學院心臟中心 寧夏銀川 750004；3.寧夏醫科大學藥劑科 寧夏銀川 750004

TNF-a基因結構和功能生物信息學預測1*

于欣1楊震2△楚元奎1于美玲3張怡清1

1.寧夏醫科大學臨床醫學院醫學檢驗系 寧夏銀川 750004；2.寧夏醫科大學臨床學院心臟中心 寧夏銀川 750004；3.寧夏醫科大學藥劑科 寧夏銀川 750004

目的：以TNF-a為研究對象，對其蛋白結構進行生物信息學預測和分析。方法：利用生物信息學軟件對基因編碼的蛋白質結構、理化性質、信號肽、跨膜結構、亞細胞定位、二級結構進行生物信息學分析。結果：TNF-a為脂溶性、胞外為主的具有信號肽分泌的蛋白，有8個磷酸化位點和7個糖激化位點，二級結構以β折疊為主；結論：TNF-a是一個很重要的細胞因子，本研究對TNF-a蛋白結構與功能的初步探索，對在蛋白質水平進一步了解TNF-a基因蛋白效應，進而探索其與高血壓及炎癥的關系。

TNF-a，生物信息學

對于蛋白質結構和功能，盡管可以通過實驗方法來實現，但利用生物信息學可以成本低且快速預測分析蛋白質結構和功能特性，尤其是對一些臨床疾病參與的蛋白質的基礎研究具有更大理論價值[1]。 伴隨著分子遺傳學在檢驗醫學中的進步,一些臨床遺傳學研究從簡單的單基因疾病轉向于復雜的多基因疾病研究如心血管疾病，高血壓，各種腫瘤，炎癥[2]等的研究中，TNF-a 是具有多種生物活性的細胞因子，TNF-a是體內與內分泌、炎癥關系最為密切的炎性因子［3］， 以自分泌以及旁分泌等多種形式對不同器官產生不一樣的生物學效應。筆者利用生物信息學一些軟件分析 TNF-a不同特點，為研究其在臨床常見疾病如高血壓發生與發展能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料序列

以登陸數列號（Accession:ADV31546.2 GI:332038858）在Genbank數據庫檢索得到人的蛋白序列。

1.2 方法

筆者通過在線獲取生物信息學軟件工具 protparam 分析TNF-a蛋白的物理和化學特性；利用軟件TargetP和PSORTⅡ綜合分析其亞細胞定位；采用軟件 SignalP4.0分析信號肽；采用TMHMM Sever對TNF-A跨膜結構進行預測；分別利用NetPhos2.0和NetOGlyc3.1對其磷酸化位點和糖基化位點進行前瞻性分析；利用生物學軟件 Smart對 TNF-a在線預測其保守結構域；利用DNAStar對其在線分析二級結構及抗原系數，所有在線工具網址見文獻［1］。

2 結果與分析

2.1 軟件分析 采用在線軟件protparam在網上對TNF-a蛋白的理化性質進行預測分析，發現TNF-a由233個氨基酸組成，分子式為 C1152H1825N313O337S6，其相對分子質量數值是25644.4，理論等電點pI是6.44；在構成TNF-a蛋白的二十種氨基酸中，Leu所占成分比例最高，占12.9%，而Met和Trp百分含量較少，占0.9%，未發現Pyl和Sec。帶負電荷氨基酸殘基數為23，帶正電荷氨基酸殘基數為22；不穩定系數為40.75，依據Guruprasad方法，分析結果提示TNF-a蛋白不穩定性；脂肪氨基酸系數是98.37，屬于脂溶性蛋白；總平均親水性為-0.047。

2.2 TNF-a蛋白信號肽分析

TNF-a分泌蛋白N端15～35位氨基酸的疏水性短肽區域，引導蛋白質的肽鏈通過內質網進入腔內，這段疏水短肽即為信號肽。本研究TNF-a蛋白信號肽是被在線工具SignalP4.0進行信號肽預測的，首先在線輸入前七十個氨基酸，利用神經網絡模型NN 和隱馬爾可夫模型HMM 進行預測，隨后給出Y、C、S－score計測結果，通過Y最大值來判斷分析信號肽剪切位點；如何判斷分泌蛋白，多利用S平均值來判斷。若S平均值高于0.5，則為分泌蛋白，存在信號肽。預測（圖1）表明，C結果值為0.427，Y結果值為0.586，S結果值為0.956，其剪切位點在29～30位氨基酸之間，且S平均值0.956大于0.5，說明TNF-a是具有信號肽的分泌蛋白。

圖1 TNF-a蛋白信號肽分析

2.3 TNF-a蛋白跨膜結構預測

膜蛋白常有以下如胞外區、跨膜區和胞內區，跨膜區就是蛋白在細胞膜內的部分，有的蛋白有一個或多個跨膜區。筆者采用生物在線軟件工具TMHMM2.0Sever對TNF-a蛋白跨膜結構進行分析，結果（圖 2）表明，TNF-a蛋白或許是由跨膜區（35～5 7位氨基酸）、胞外區（蛋白的58～233位氨基酸處于細胞膜表面）以及胞內區（1～34位氨基酸）部分構成的膜蛋白。

圖2 TNF-a蛋白的跨膜結構分析

2.4 TNF-a蛋白的極性預測分析

筆者采用在線軟件 protscale把 TNF-a蛋白極性進行結果Zimmerman分析，結果( 圖3) 顯示該蛋白多肽鏈Arg氨基酸是最高分值52.0；Leu具有最低分值0.130。

圖3 TNF-a蛋白的極性預測分析

2.5 TNF-a蛋白的亞細胞定位分析

把 TNF-a蛋白蛋白序列輸入在線亞細胞定位生物信息工具TargetP（由丹麥TeKniske大學生物學序列分析中心提供）。在序列來源項選擇noplant ，其他選項用默認值由返回的結果，表明該蛋白大部分（值為 0.891）集中在細胞其它位置。進一步登錄日本的PSORTII Prediction，利用the k-NN Prediction分析，基本確認該TNF-a蛋白分子屬于分泌蛋白。主要在11.1 %胞核；胞漿44.4 %； 高爾基體33.3 %； 線粒體11.1 %分泌合成中發揮生物學作用。

2.6 TNF-a蛋白翻譯后修飾位點分析

在真核生物中，蛋白質翻譯后修飾過程常見的有糖基化和磷酸化兩種。糖基化通常是修飾天冬酰胺上的N端。其氨基酸的特征序列為 Asn －X－ Ser －Thr， X可表示為任一種氨基酸。機體一些蛋白需要糖分子/糖鏈等與其它分子相互作用發揮生物學作用； 磷酸化多具有功能開關作用，當機體蛋白被磷酸化后方能具備調控生物體功能代謝的作用；筆者采用在線軟件工具Netphos2.0 Server和NetOGlyc4.0 Server對TNF-a蛋白進行預測，其預測表明有 8個 Ser（5,27,68,79,80,81,85,209），3個 Thr（83,165,181），4個Tyr（132,191,195,217）可能成為蛋白激酶磷酸化位點；有下列7個糖基化位點分別為68,71,79,80,81,83,85位點。

圖4 TNF-a蛋白翻譯后修飾位點分析

2.7 TNF-a蛋白的二級結構分析

多肽鏈中的主鏈借助氫鍵形成有規則卷曲折疊的一維構象為蛋白質二級結構。本研究利用DNAstar在線預測TNF-a蛋白的二級結構和抗原表位（如圖 5），綜合 Gamien-Robson和Chou-Famsman2兩種方法，預測發現TNF-a的二級結構主要是α螺旋結構：28.3% 和18.9%；β折疊：51.5%和41.2% ，轉角13.7%和34.3%和無規則卷曲7.73%。根據Jameson woff預測TNF-a的氨基酸，抗原指數最小值是0.6，最大值3.4，平均值0.59，高于3.0的區域主要是20～21, 26,65, 80～82, 86, 177, 216區段，提示該區域可能是優勢抗原表位。預測 TNF-a的氨基酸親水性最小值-2.68，最大值2.60，平均值0.06，在30～55氨基酸明顯低于平均值。

圖5 TNF-a蛋白的二級結構

3 討 論

1975 年， CarsweII 等給接種卡介苗的小鼠通過注射脂多糖后，觀察發現該鼠血清中含有能引起腫瘤出血壞死的活性因子可，稱為腫瘤壞死因子( TNF) 。TNF被分類TNF-α和 TNF-β兩大類，其多由活化的單核細胞、巨噬細胞釋放產生，又稱惡液素。眾所周知真核生物如單核細胞等進行蛋白質翻譯后的修飾過程主要有蛋白質的糖基化和磷酸化，其中蛋白糖基化主要是修飾天冬酰胺上的N端，這種糖基化修飾可以對免疫分子的結構和功能有一定影響，從而改變機體對抗原的應答反應［4］，同時蛋白糖基化作用與某些疾病也有緊密關系，如艾滋病患者所攜帶的HIVgp 120位點上的寡甘露糖位點可以成為潛在的治療靶位點［5］。本研究結果發現NetOGlyc4.0 Server對TNF-a蛋白進行預測，有下列7個糖基化位點分別為68,71,79,80,81,83,85位點，結合蛋白二級結構分析結果， 其中ser68位于α 螺旋上，69leu、71ser和 79ser位于β－折疊片上， 這些不同位點修飾后的TNF與高血壓等有密切關系[6,7,8]。筆者采用生物在線軟件工具TMHMM2.0Sever對TNF-a蛋白跨膜結構進行分析，結果顯示，TNF-a蛋白或許是由跨膜區（35～57位氨基酸）、胞外區（蛋白的 58～233位氨基酸處于細胞膜表面）以及胞內區（1～34位氨基酸）部分構成的膜蛋白。預測TNF-a的氨基酸親水性在30～55氨基酸明顯低于平均值，說明跨膜區域與親水區域一致，故揣測蛋白可能是一個與細胞信號傳導有關的膜受體蛋白。利用神經網絡模型NN 和隱馬爾可夫模型HMM 進行預測，TNF剪切位點在29～30位氨基酸之間,是具有信號肽的分泌蛋白。腎小管上皮細胞 TLR4 的活化能特異性的激活核因子出( NF-KB) 途徑，啟動 IL-6、8、12，TNF-α 和輔助刺激因子CD80、 86 等基因的轉錄， 促使細胞趨化因子的釋放以及巨噬細胞的浸潤，激活急性腎小管損傷中的免疫應答。TNF-α 在細胞免疫、腫瘤免疫等多種生理和病理過程中發揮關鍵作用，同時TNF-α 和機體的炎癥反應、 免疫反應都有著密切關系［9］。高血壓時增高的 IL-6 和TNF-α 提升了機體的炎癥免疫反應， 產生過多的免疫復合物，這些免疫復合物可直接增加腎小球通透性，同時可激活補體，產生 C3a、C5a 等趨化因子吸引炎癥細胞，釋放炎癥因子、蛋白溶解酶、活性氧，導致腎組織損害。腫瘤壞死因子-α( TNF-α)是腎臟疾病進展中的重要調節因子之一。

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Bioinformatics prediction of TNF-a gene structure and function

Yu Xin1Yang Zhen2△Chu Yuankui1Zhang Yiqing1YuMeiling1
1 Department of Laboratory Medicine in clinical school, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 2 Heart Center, the Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China；3 Department of Pharmacy, The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, 750004,Yinchuan, China

Objective:To analysis the bioinformatics of TNF-a gene structure and function.Methods: by means of bioinformatics methods,mainly focused on ananalyzing its encoding protein including its structure ,physical and chemical properties,signal peptide, transmembranes structure, subcellar localization,secondary structure ,higher structure and so on.Results:The results indicated TNF-a protein was stable fat soluble transmembrane protein,located cellular exterior.There are eight phosphorylation sites and seven sugar activation sites ,the secondary structure was primarily composed β fold.Conclusion: TNF - a is a very important cytokines, this study of TNF - a protein structure and function of the bioinformatics prediction, could further strenthen the understand the TNF - a gene and protein effect, and to explore its function and relationship with high blood pressure and inflammation.

TNF-a , Bioinformatics

R737.25

A

1672-5018（2016）11-002-02

國家自然科學基金（81260265）

1.作者簡介：于欣(1977-)，副教授，主要從事心血管疾病的臨床血液免疫分子生物學實驗室研究。△通訊作者，Email: yangzhen080@163.com