鵝顆粒細胞轉錄因子GATA結合蛋白4（GATA4）真核表達質粒的構建

摘 要：【目的】本研究旨在構建鵝顆粒細胞轉錄因子GATA結合蛋白4（GATA4）綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-N1/GATA4，為研究GATA4在鵝顆粒細胞中功能作用奠定實驗基礎。【方法】原代培養鵝顆粒細胞，取細胞總RNA，RT-PCR擴增出GATA4 cDNA基因片段，克隆連接至載體PMD19-T，用限制性內切酶EcoRI及BanHI酶切，鑒定克隆產物為所需的目的基因片段后，膠回收目的基因，并進行序列測定，然后將上述膠回收產物與載體pEGFP-N1連接，導入感受態DH5α，菌液涂于含卡那霉素瓊脂糖平板上，挑取抗性單菌落，進行質粒DNA擴增，酶切及測序鑒定，證實均為陽性克隆，即GATA4與pEGFP-N1體外重組成功。【結論】采用體外重組技術，成功將鵝GATA4 cDNA插入熒光蛋白表達載體pEGFP-N1中。

關鍵詞：GATA4；真核表達載體；質粒pEGFP-N1；克隆

中圖分類號：S835 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2016）10-0058-03

GATA家族能與核酸共同序列（A/T）GATA（A/G）相結合的一類轉錄因子，包括6個成員，即GATA1、2、3、4、5和6。其中，只有GATA4和GATA6在卵巢顆粒細胞中共同表達，GATA4與小鼠、豬、人等的卵巢顆粒細胞分化、增殖、凋亡以及卵泡閉鎖等功能關系密切；而GATA6在卵巢顆粒細胞中功能尚不清楚。目前有關探討GATA4和GATA6在鵝卵巢顆粒細胞中的功能研究報道較少，本實驗以天府肉鵝母系為試驗材料，構建GATA4真核表達載體，從而為進一步研究GATA4對下游靶基因、類固醇激素合成、顆粒細胞增殖凋亡等奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

異丙醇、氯仿、無水乙醇和氯化鈉等試劑均為國產；DNA Marker 2000、 Master Mix等均從北京天根公司購買；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、瓊脂粉、PMD19-T 載體試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；提取總RNA所用TRIzol Reagent為Invitrogen 公司產品；Plasmid mini Preparation Kit（200）質粒提取試劑盒購于碧云天生物技術研究所。引物的合成和序列測定由上海生工完成。

1.1.2 質粒與菌株

質粒pEGFP-N1由四川農業大學動物遺傳育種研究所提供，DH5α感受態細胞購自天根生化科技（北京）。

1.2 方法

1.2.1 鵝原代顆粒細胞培養

取高產期四川白鵝卵巢，分離卵泡的顆粒層，接種于含有10 %胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 U/mL的DMEM培養液中，于37 ℃、 5 %CO2、飽和溫濕度下培養，每兩天換液1次。

1.2.2 細胞總RNA的提取

培養的鵝顆粒細胞，1 000 rpm離心6 min，收集細胞。以TRIzol試劑盒抽提細胞總RNA，紫外分光光度法測定A260/A280，使用的標本符合A260/A280 介于1.8～2.0

1.2.3 鵝GATA-4基因擴增片段的引物設計及合成

根據GATA4基因序列（登陸號：KC454275）設計引物T1、T2擴增全長GATA4，上下游引物分別在5’端引入EcoRI及BanHI酶切位點，上游引物T1為：5’-CCGGAATTCATGTACCAGAGCTTAGCCA-3’；下游引物T2為：5’-CGCGGATCCTTATGCCGTTATGATGTCCC-3’。產物長度1 236 bp。

1.2.4 RT-PCR體外擴增目的基因片段

參照上述提取RNA步驟提取鵝顆粒細胞總RNA，逆轉錄生成cDNA。PCR擴增目的基因，擴增的反應體系，反應條件為94 ℃預變性5 min， 94 ℃變形30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40個反應循環，72 ℃最后延伸5 min。

1.2.5 目的基因片段PCR產物的純化、克隆

PCR產物經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，膠回收PCR產物，克隆連接至PMD19-T，將克隆有目的基因GATA4的重組質粒PMD19-T/GATA4進行酶切驗證，并進行序列測定，以檢測其核苷酸序列與GATA4基因序列的編碼區是否完全一致。EcoRⅠ和BamH I酶切位點已事先添加在目的基因GATA4上下游。

1.2.6 重組載體pEGFP-N1/TNFR 1的構建、篩選與鑒定

將上述酶切產物與載體pEGFP-N1連接，連接產物室溫下過夜，然后將新質粒導入感受態DH5α，菌液涂于含卡那霉素瓊脂糖平板上，37 ℃過夜培養，挑取抗性單菌落，進行質粒DNA擴增，應用質粒提取試劑盒抽提質粒DNA，用EcoR I和BamH I限制性內切酶進行酶切，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳篩選，最終篩選出質粒并再次進行目的基因的測序驗證。

2 結果

2.1 卵巢RNA提取結果

本試驗采用Trizol法進行鵝顆粒細胞總RNA提取，經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳結果顯示（圖1），18S和28S條帶清晰，5S條帶較弱，表示得到的RNA無降解，無DNA污染，可以進行下一步試驗。

2.2 質粒的鑒定

所有產物在1.5 %瓊脂糖上進行檢測（圖2），GATA4 cDNA全1 236 bp（1.2 kb），之后連接到pMD19-T載體上，通過EcoR I和BamH I進行雙酶切，電泳圖如圖2B所示，產生2條帶，一條1.2 kb左右的目的帶，一條2.7 kb左右的載體帶。酶切后進一步的連接到pEGFP-N1載體上，雙酶切后電泳檢測，圖2C所示，一條目的帶（1.2 kb）和一條載體帶（4.7 kb）。挑選陽性克隆并測序，與之前獲得并提交的GATA-4序列完全一致。

2.4 重組質粒pEGFP-N1/GATA4插入GATA4基因核苷酸序列的測定。

測序結果顯示重組質粒pEGFP-N1/GATA4中插入基因長1 236 bp，為一開放閱讀框架，與Genebank中公布的鵝GATA4 mRNA基因完全相符，且方向正確。

3 討論

在前期實驗中，我們已經報道了GATA4基因完整編碼區序列、分子結構，以及在鵝卵泡發育過程中的表達模式[1]。研究已證實GATA4在類固醇生成、性別分化和細胞凋亡方面具有重要的作用[2]，其在卵巢方面的功能作用就是調節GATA依賴性的靶基因的翻譯后修飾[3]，GATA4磷酸化水平是由cAMP通過PKA途徑進行調節的[4]，磷酸化增加了GATA4的DNA結合能力并且反式激活下游多個靶基因的啟動子，包括STAR [5]、CYP19A1[6]、CYP11A1[7]、BCL2[8]、INHA[9]、GnRHR[10]等與卵泡發育有重要作用的基因。

此外，GATA4表達的上調伴隨著人和小鼠初級卵泡顆粒細胞的快速增殖[11]，下調GATA4表達則與鼠的顆粒細胞凋亡有關，并且伴隨著成年小鼠卵巢的閉鎖[12]。促性腺激素（PMSG、FSH）也對GATA4的表達具有上調作用[12]。這些都表明GATA4是多種類固醇激素合成基因的轉錄調控者，通過激活器目標基因的轉錄，介導和調節類固醇激素正常分泌與表達過程，間接參與顆粒細胞分化及凋亡調節，從而調節卵泡的發育。

本試驗欲為了深入研究GATA4調節鵝卵巢顆粒細胞中重要的GATA依賴性的靶基因的翻譯后修飾的功能，首次成功構建了GATA4真核表達載體pEGFP-N1/GATA4，為后續研究GATA4基因怎樣通過翻譯后修飾調控靶基因的功能以及對顆粒細胞增值凋亡，卵泡發育的影響等奠定實驗基礎。