紅細胞膜磷脂水平與急性缺血性卒中的關系

[摘要] 目的 該文采用高效液相色譜技術，對急性缺血性卒中患者紅細胞膜磷脂含量分析，探討紅細胞膜磷脂水平在急性缺血性卒中發生、發展中的作用機制。方法 采用流行病學橫斷面調查方法，自2015年7—10月篩選病例組人群22例，健康對照組人群24名，分離紅細胞膜，用HPLC，XBP-Silica柱分離，測定兩組人群紅細胞膜磷脂含量，數據采用SPSS 20.0統計學軟件分析。結果 5種磷脂中脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）3種磷脂病例組含量（0.3796±0.1387）、（0.4498±0.1786）、（0.3301±0.0327）與對照組（0.4897±0.0154）、（0.5523±0.0107）、（0.6351±0.0599）數值差異有統計學意義（P< 0.05），磷脂酰肌醇（PI）和神經鞘磷脂（SM）差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 紅細胞膜磷脂水平參與影響了急性缺血性卒中的發生發展過程，可能是急性缺血性卒中發生發展的一個誘導機制。

[關鍵詞] 急性缺血性卒中；紅細胞膜；磷脂

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）12（a）-0031-04

腦卒中是一種高發病率、高致殘率、高死亡率的疾病。而缺血性卒中在我國約占卒中總數的70%[1]。大量研究發現急性缺血性卒中患者存在紅細胞膜脂質成分的改變，但對紅細胞膜磷脂含量的變化，結論不一。組成細胞膜的磷脂主要包括磷酯酰絲氨酸（PS）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神經鞘磷脂（SM）等，這些磷脂在血細胞膜上的含量遠遠大于血清中的含量。因此該文采用高效液相色譜（HPLC）技術高效液相色譜法自2015年7—10月對篩選病例組人群22例，健康對照組人群24名患者血清中 5 種磷脂磷脂含量水平分析，從而探討紅細胞膜磷脂水平與急性缺血性卒中的關系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜（Agilent 1260），超聲波清洗器（ KQ-100DB），超純水儀（Millipore美國），分析天平（AR1140，美國）。磷脂酰絲氨酸標準品（PS 90%） 、磷脂酰膽堿標準品（PC 98%） 、磷脂酰肌醇標準品（PI 98%） 、磷脂酰乙醇胺標準品（PE 98%）、神經鞘磷脂標準品（SM 98%） 均購自瑞典Larodan 公司；乙腈、甲醇、磷酸、氯仿、己烷、異丙醇（ 天津市光復精細化工研究所） 。

1.2 調查對象收集與篩選

該研究對象來自黑龍江省林總醫院自2015年7—10月住院的急性缺血性卒中患者，年齡在60～75歲之間，共計22例（男12例/女10例），排除冠心病、糖尿病及其他具有精神疾病者等，作為病例組。對照組在哈爾濱第二福利醫院健康老年人中選取，年齡與病例組相匹配，共計24人（男12/女12）。所有研究對象均由本人或監護人簽署知情倫理同意書，自愿參加和退出，自愿接受問卷調查和實驗室檢查。

1.3 紅細胞膜中磷脂的提取

取受試對象晨起空腹肘靜脈血，經低溫離心、洗滌、沉淀等處理，獲得白色的紅細胞膜樣品。然后，取紅細胞膜懸浮液加入0.5 mL的提取液[氯仿-甲醇（體積比2：1）]，冰浴勻漿3 min。加入提取液4 mL，于30℃保溫30 min，以3 000 r/min離心5 min，取下層液過濾除蛋白。濾液加0.9%Nacl 0.4 mL，振搖1 min，以3 000 r/min離心5 min，棄上層液。加0.4 mL氯仿-甲醇-水（體積比8：4：3）振搖、靜置，以3 000 r/min離心5 min，棄上層液，氮氣吹干。殘渣用 2 mL 正己烷-異丙醇（3∶1） 溶解，經有機濾膜過濾于樣品瓶，備用。

1.4 色譜條件

流動相為乙腈：甲醇：85%磷酸（體積比為100：10：1.8）。色譜分析柱以XBP-Silica （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相檢測波長為203 nm，進樣量10 μL，柱溫25℃，流速1.5 μL/min。

1.5 樣品測定

取處理完成的紅細胞膜磷脂提取物，在上訴色譜條件下，取10 μL進樣分析，同時繪制標準曲線，采用外標法定量，相對保留時間定性。標準色譜圖和樣品圖見圖1。

1.6 統計方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據統計分析，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，組間資料比較采用ANOVA檢驗， P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 方法的質量控制

2.1.1 線性范圍和檢出限 該文以外標方法進行定量分析，因此對方法的線性范圍和檢出限進行了試驗，以峰面積（x） 對磷脂濃度（y） 做線性回歸，按色譜峰的 3 倍信噪比（S/N） 計算各磷脂組分的檢測限（LOD），10倍（S/N） 信噪比確定定量限（LOQ），結果見表1。從表1可見，該方法線性關系良好。

2.1.2 重復性實驗 取高、中、低3種濃度的磷脂混合溶液，各濃度平行測定6次，計算精密度；在1 d內重復進樣6次并連續進樣6 d。結果見表2，各磷脂的變異系數均小于1.99%，PI、PC、PS、PE、SM的日內與日間變異均小于1.86%，該方法精密度良好。

1.2.3 準確度 取血清樣品 100 μL，加入 5 種磷脂混合標準溶液，分高、中、低 3 個濃度，考察方法準確度。結果回收率PI為82.06%～97.00%；PE為88.12%～104.36%；PC為90.39%～104.53%；PS為90.46%～99.17%；SM為86.57%～104.55%。顯出良好的準確性。

2.2 CVA組與對照組紅細胞膜磷脂水平

表3列出了病例組組與對照組紅細胞膜中5種磷脂的測定結果，從中可見磷酯酰絲氨酸（PS）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）的含量差異有統計學意義（PS：P<0.001、PC：P<0.01、PE：P<0.01）。五種磷脂的總含量（PL），相對于對照組，病例組明顯減少（P< 0.001），而紅細胞膜中磷脂酰肌醇（PI）和神經鞘磷脂（SM）在病例組與對照組之間差異無統計學意義P>0.05。

為衡量脂質過氧化程度，比較細胞膜成分變化，我們將甘油磷脂與神經鞘磷脂做比率，結果如表4所示。PI/SM的比值在CVA組與病例組中差異無統計學意義（P>0.05）；PC/SM在CVA組與病例組間差異無統計學意義（P > 0.05）；PE/SM在CVA組與對照組間差異有統計學意義（P<0.001）；PS/SM在CVA與病例組之間差異有統計學意義（P <0.001），以上結果提示紅細胞處于高水平脂質過氧化狀態。

3 討論

紅細胞膜的主體為磷脂排列的雙分子層的結構，其中包含蛋白質貫穿在細胞膜中，紅細胞膜的磷脂作為紅細胞的重要組成成分，其包括組成內層的磷酯酰絲氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）和組成外層的磷脂酰膽堿（PC）和神經鞘磷脂（SM）[2]。紅細胞膜磷脂中PS包含大量的二十二碳六烯和花生四烯酸[3]。在人類紅細胞膜中PS比PE、PC含有更多的PUFA[4]。磷脂富含大量PUFA易發生氧化應激，之前有研究報道過當紅細胞與叔丁基過氧化物反應SM相對于PC、PE、PS的組分增加，因此，每個甘油磷脂與SM的比率是一個很好的恒量過氧化程度指標。

PS通過甲基化可生成乙酰膽堿的前體物質即磷脂酰膽堿，PS還可以調節細胞膜的流動性，并介導細胞膜受體與第二信使間的相互作用；Suzuki等[5]發現，PS具有促進乙酰膽堿的釋放的作用。PE在體內不同的磷脂酶作用下，可水解成甘油、不飽和脂肪酸、膽堿和磷脂，這些成分在體內有著非常重要的生物學作用。其中，膽堿在體內生物酶的作用下與乙酰輔酶A反應生成乙酰膽堿，乙酰膽堿對于大腦記憶區膽堿能神經元及神經突觸的形成有關鍵性作用，可促進腦發育，提高記憶能力[6]。并且越來越多的研究表明腦卒中病的進程與炎癥相關，而脂類介質在炎癥消退的過程中發揮了特殊的起動作用，如不飽和脂肪酸（PUFAs），其作為PE的水解產物可能是腦卒中病的保護因素。G-6-P酶具有較強的磷脂依賴性，其依賴于PE，參與許多糖代謝途徑。糖代謝異常或許成為重要的急性缺血性腦卒中發病機制。有研究顯示，在急性缺血性腦卒中患者早期腦內某些區域具有異常的葡萄糖代謝率及能量代謝障礙[7]。SM可以在神經酶的作用下形成神經酰胺，而近年來研究發現，神經酰胺的超量集聚或許與某些代謝綜合征有著緊密的聯系[8]。實驗結果顯示，病例組與對照組相比，紅細胞膜中PE/SM（×100）[HC=49.7±8.1，CVA=44.91±6.6]、PS/SM（×100）[HC=14.8±7.2，CVA=8.3±7.4]的比值有所降低，而PC/SM和PI/SM在病例組和對照組中之間差異無統計學意義（P> 0.05）。參照鄧華聰等[9]研究中細胞膜磷脂發生過氧化時PE/SM（×100）[HC=141.8±22.7，CVA=144.2±31.4]、PS/SM（×100）[HC=75.3±14.1，CVA=63.85±16.9]，該實驗中PE/SM、PS/SM遠遠小于上述數值，表明紅細胞處于較高水平的脂質過氧化反應。ROS的過量產生會引發機體抗氧化失衡，使細胞膜受到氧化攻擊產生損傷，破壞細胞膜的完整性，最終導致細胞結構和功能的改變。

綜上所述，急性缺血性卒中患者同對照組研究對象相比，磷脂水平明顯降低，甘油酰磷脂與神經鞘磷脂的比值PE/SM、PS/SM在病例組與對照組有統計學差異，膜磷脂含量發生改變提示紅細胞膜磷脂的高水平過氧化反應。表明急性缺血性卒中患者磷脂水平可能在急性缺血性卒中的發生發展中發揮重要作用，這可能作為腦卒中未來靶向治療研究的一個方向。

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（收稿日期：2016-09-09）