DHMEQ對降植烷誘導的狼瘡性腎炎的作用及機制研究

[摘要] 目的 探討NF-κB抑制劑DHMEQ對降植烷誘導狼瘡性腎炎小鼠模型的作用。方法 方便選取2012年7月—2015年12月用降植烷誘導形成狼瘡性腎炎動物模型24例，研究DHMEQ對該模型的治療效果，探討DHMEQ對狼瘡性腎炎的影響。結果 DHMEQ拮抗升高的抗核小體，抗dsDNA抗體和抗組蛋白自身抗體以及 IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α起到拮抗作用。DHMEQ可降低降植烷誘發的腎臟病變。磷酸化p38促分裂原活化蛋白激酶 （MAPK），磷酸化c Jun氨基末端激酶（JNK）和NFκBp65的腎表達水平（MAPK）顯著下調。結論 DHMEQ通過調節細胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信號通路對降植烷誘導狼瘡性腎炎產生有利影響。

[關鍵詞] 狼瘡性腎炎；NF κB；脫氫環氧甲基醌霉素（DHMEQ）

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2016）12（a）-0027-04

系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種以體液自身免疫引起細胞和先天免疫反應為特征的自身免疫性疾病的原型[1]。狼瘡性腎炎（LN）與SLE的不良預后相關。雖然激素聯合免疫抑制劑顯著改善了狼瘡性腎炎患者的預后，但是也增加了感染和腫瘤的發生幾率，因此急需新的治療手段。NFκB作為參與免疫應答調控的關鍵轉錄因子，在多個研究中發現其參與自身免疫性疾病的發生發展[2]。NF κB在很多信號通路[3]的交匯點發揮作用。因此，通過抑制NFκB信號通路可以改善狼瘡性腎炎[4]。從2012年7月—2015年12月，選取BALB/c 小鼠24例，通過降植烷誘導形成狼瘡性腎炎動物模型24例，研究DHMEQ對該模型的治療效果，探討DHMEQ對狼瘡性腎炎的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/ c小鼠[年齡8周，體重（18±2）g]24只由山東大學實驗動物中心提供。該研究經過濱州醫學院附屬醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

雌性BALB/ c小鼠，隨機分為對照組和DHMEQ治療組（n=12）。小鼠8周齡注射降植烷，16周齡后給予腹腔注射終濃度1.2 mg/mL DHMEQ或配藥液，3次/周，持續注射16周，直到小鼠達到32周齡。分別于8周，16周和32周采集尾靜脈血檢測自身抗體的水平。小鼠于32周時頸椎脫臼法處死并取腎臟組織用于免疫學檢測和鏡下檢測。

1.3 自身抗體檢測

用酶聯免疫測定法（ELISA）對血清IgG抗核小體抗體，dsDNA和組蛋白水平進行檢測。流式細胞術來檢測小鼠IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α的水平。

1.4 腎功能評估

為了評估尿蛋白排泄量，將小鼠置于代謝籠中并于24 h內收集尿樣?？捡R斯亮藍法測定蛋白濃度。獲取處死小鼠后，取腎臟切片以及年齡匹配的C57BL/6對照小鼠，用Olympus BX60顯微鏡進行分析。用Image J軟件對染色強度進行定量分析。

1.5 腎臟蛋白質印跡分析

蛋白提取使用RIPA試劑。上樣量為20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。2% BSA封閉后，孵育于1∶2 000稀釋的一抗檢測p p38 MAPK，p JNK或 NF κB p65，使用HRP二抗，ECL發光液顯色后，通過圖像分析系統進行定量。GAPDH作為對照。

1.6 統計方法

數據使用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（x±s）表示。對數據進行t檢驗和單因素方差檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DHMEQ降低抗dsDNA抗體，抗核小體和抗組蛋白抗體的血清水平

在16周和32周，對照組的血清dsDNA抗體水平明顯增加。與對照組相比，DHMEQ組dsDNA抗體水平在32周明顯降低（圖1A）。同樣， DHMEQ組的血清抗核小體和抗組蛋白抗體水平在32周時也顯著下降（圖1B和C）。

2.2 DHMEQ減少炎性細胞因子的表達作用

對照組的IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α的水平明顯增加。DHMEQ治療組的細胞因子水平幾乎正常，明顯低于對照組（P <0.05，圖2）。

2.3 DHMEQ降低降植烷誘導狼瘡小鼠中的狼瘡性腎炎

在32周時（24周內給予降植烷注射），DHMEQ組的尿蛋白排泄量較對照組明顯降低。另外， DHMEQ組的腎臟HE染色切片顯示腎小球損傷小于對照組（圖3B）。

2.4 DHMEQ抑制腎臟NF -κB和JNK/ P38 MAPK信號通路

NFκB p65蛋白作為NFκB信號活化的指標，經DHMEQ處理后下調。而且降植烷誘導狼瘡小鼠中的JNK磷酸化水平和p38蛋白在小鼠腎組織的水平明顯降低。

3 討論

DHMEQ是由擬無枝酸菌屬的菌種發酵純化制得的抗生素。與其他NF-κB抑制劑靶向IκBα的磷酸化水平不同，DHMEQ抑制NF-κB的組成部分p65的核轉位 8。DHMEQ在動物中未表現出明顯的毒性[7-8]，表明該化合物的安全性。該研究發現DHMEQ可以拮抗狼瘡中不斷增加的抗核小體，抗dsDNA抗體和抗組蛋白抗體，以及TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-17水平。此外，可顯著減少降植烷引起的腎臟病變，表現為降低蛋白尿和腎小球病理變化的降低。 p38MAPK， p JNK和NF - κBp65的腎表達水平被顯著下調。上述研究結果表明，DHMEQ通過調節細胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信號通路對降植烷誘導的狼瘡性腎炎產生有利影響。

NF-κB活化基礎水平的升高與慢性炎癥性疾病[9]相關聯。NFκB家族的轉錄因子是由抑制劑，包括IκBα來調節的。與野生型小鼠相比，易感狼瘡小鼠的脾臟和樹突狀（DC）細胞中發現IκBα的表達水平較低，表明NFκB在狼瘡小鼠中異常活化。NFκB可以影響DC的功能并調節其適應性免疫4的能力。現已證實，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）中[10]觀察到NFκB阻滯干擾不必要的T細胞應答。此外，在自發狼瘡模型MRL / lpr小鼠中，抑制NFκB介導的炎癥反應證明對LN有效[11]。該研究提供了新的證據表明NFκB的藥物抑制在降植烷誘導狼瘡小鼠中可能顯著降低狼瘡疾病的不良影響。

越來越多的證據表明NFκB參與自身反應性T和B淋巴細胞發育，存活和增殖，并通過細胞因子（包括TNF-α，IL-1，IL-6和IL-17）參與維持慢性炎癥。因此，NFκB介導的炎癥反應可能有助于SLE的器官損傷11。在該研究中我們發現DHMEQ能夠拮抗不斷提高的IL-1β，IL-6和IL-17和腫瘤壞死因子α水平。此外，一些研究表明p38 MAPK/JNK信號轉導通路在調節細胞和體液免疫應答[12-13]中起重要作用。現已證明DHMEQ作為p38 MAPK的特異性抑制劑，在SLE的MRL/lpr小鼠模型中是有效的，表現為能夠改善腎功能和減少組織學損傷[13]。該研究的發現，通過DHMEQ處理能夠抑制MAPK/JNK信號傳導途徑。這些結果表明，DHMEQ通過阻斷NFκB/ MAPK/JNK介導的炎性反應在SLE中發揮治療作用。

總之，該研究的結果表明DHMEQ通過調節細胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信號通路對降植烷誘導狼瘡性腎炎產生有利影響。該結果支持了NFκB阻滯可能是減少有害的自身免疫反應的重要藥物方法的假設。

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（收稿日期：2016-09-08）