幾株水產用芽孢桿菌的功能分析

楊宇嘉+陳營

摘 要：芽孢桿菌由于功能性強，作用明顯，被廣泛應用于水產養殖中。為得到一株能有效凈化養殖水環境的菌株，本試驗從7株芽孢桿菌中篩選出具有高效降氨氮、亞硝態氮、產酶的菌種，其中C24的氨氮去除率達到75%；C22的亞硝態氮去除率可達64%；C12和C13產蛋白酶、淀粉酶能力突出。研究認為可作為水產微生物制劑的候選菌種。

關鍵詞：氨氮；亞硝酸鹽；微生物制劑；水產養殖

中圖分類號：S942.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.05.013

Analysis of Function of Several Strains of Bacillus in Aquaculture

YANG Yujia， CHEN Ying

（College of Life Sciences， Yantai University， Yantai， Shandong 264005， China）

Abstract： Bacillus is widely used in aquaculture， because of its functional， obvious effect. To obtain a strain which can effectively purify the water environment， in this study， the strains was screened from 7 Bacillus which have efficient ability of decomposition of ammonia， nitrite， enzyme production， among which the ammonia removal rate of Bacillus C24 reached 75%， the nitrite nitrogen removal rate of Bacillus C22 was 64%， the protease， amylase ability of Bacillus C12 and C13 were highlight. It could be used as a candidate species for aquatic microbial agents.

Key words： ammonia； nitrite； microbial agents； aquaculture

近年來，我國水產養殖業不斷發展，隨著養殖規模逐漸擴大，養殖密集度、繼續惡化程度的加深，養殖環境與水浴生態環境的矛盾也日益突出。我國的水產養殖方式大多為靜水養殖，養殖動物的活動、攝食、排泄都在同一池塘內進行，并且以單一品種高密度養殖為主，嚴重破壞了生態系統的平衡[1]。在高密度養殖中，由于飼料的過量投喂，水產動物排泄物的積累以及漁藥濫用，使得養殖水體不斷惡化[2]。水體污染物有來自于余料殘餌中殘留的蛋白質和淀粉，養殖動物糞便、殘餌分解及肥料中的大量氨氮、亞硝酸氮和硫化物等，水質好壞直接關系著水產養殖的經濟效益。而如何調節和改善水體環境，降低和去除水體污染物（有機物、氨氮、亞硝酸鹽）已經成為凈化養殖水質的研究熱點[3]。就目前來看，用傳統的物理及化學方法處理水體氨氮污染，雖然見效快，但投入較大，且容易引起二次污染，而利用微生物調節養殖水體水質被認為是目前最為經濟、生態、環保的方法[4-6]。

芽孢桿菌因其具有生長速度快、易培養、抗逆性強等優點，已被越來越多的人所關注，芽孢桿菌具有高活性的消化酶系，能夠分解養殖水體中的各種大分子有機物，謝航等研究表明，地衣芽孢桿菌在適宜的水體生態條件下對飼料殘餌中的蛋白質與淀粉降解率為60%左右[7]。有些芽孢桿菌還能降解水體中的氨氮和亞硝酸氮等有毒物質，凈化水質，有研究表明，巨大芽孢桿菌在氨氮初始濃度為50 mg·L-1的環境下，24 h的氨氮降解率在95%以上[8]。同時芽孢桿菌還能抑制某些病原微生物的生長[9]，提高免疫力，使養殖動物免受病害。因此，芽孢桿菌作為水產微生物制劑的菌株具有廣闊的應用前景[10]。

本試驗探究幾株市售產品中分離的芽孢桿菌的功能，研究它們的生長穩定性、有機物分解能力和氨氮、亞硝酸氮去除能力，為以后開發研制高效凈水微生物制劑提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌種：從不同種市售芽孢桿菌產品中提取分離得到7株芽孢桿菌，分別是C10-2、C12、C13、C15、C22、C23和C24。留種保存。

主要培養基如下。

（1）牛肉膏蛋白胨培養基（g·L-1）：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，固體培養基加1.5%的瓊脂。

（2）生長速度測定培養基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 1 g，（NH4）2SO4 10 g，酵母膏0.5 g，MgSO4 0.4 g，水1 000 mL，pH 值7.0～7.2、115 ℃滅菌30 min。

（3）酪素水解培養基（g·L-1）：脫脂奶粉50 g，固體培養基加1.5%的瓊脂。

（4）淀粉水解培養基（g·L-1）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，固體培養基加1.5%的瓊脂。

（5）卵磷脂酶測定培養基（g·L-1）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，體積比1∶1的卵黃鹽水溶液50 mL，固體培養基加1.5%的瓊脂。

（6）耐鹽性培養基：含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液體培養基。

（7）耐堿性培養基：pH值為10的牛肉膏蛋白胨液體培養基。

（8）氨氮降解篩選和測定培養基（g·L-1）：葡萄糖5.0 g，NH4Cl 2.0 g，NaCl 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.2 g， pH 值7.0～7.5，固體培養基加1.5%的瓊脂。endprint

（9）亞硝酸氮測定培養基（g·L-1）：葡萄糖4.0 g，NaNO2 0.5 g，K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4 0.2 g，蛋白胨1.0 g， pH 值7.0～7.5，固體培養基加1.5%的瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 在無菌條件下取適量菌種接種于20 mL牛肉膏蛋白胨培養基，28 ℃，100 r·min-1搖床振蕩培養24 h（厭氧菌28 ℃靜置培養72 h），于4 ℃保存。

1.2.2 微生物生長速率試驗 取活化后的菌液各200 μL，分別接種于20 mL培養基，28 ℃、100 r·min-1搖床振蕩培養（厭氧菌靜置培養）12和24 h（厭氧菌培養24和72 h），無菌條件下取適量菌液測定菌液濃度。

1.2.3 有機物分解試驗 各取5 μL活化好的菌液，分別點種在酪素平板、淀粉平板和卵磷脂平板上，每個平板上點種3個點，置于28 ℃培養箱內倒置培養24 h（厭氧菌培養72 h），并觀察試驗結果。

1.2.4 耐鹽耐堿性試驗 取活化后的菌液各200 μL，分別接種于20 mL含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液體培養基和pH 值為10的牛肉膏蛋白胨液體培養基上，于28 ℃、100 ·min-1搖床振蕩培養（厭氧菌靜置培養），培養 24 h（厭氧菌培養72 h）。

1.2.5 抑菌性試驗 采用濾紙片法分別浸潤芽孢菌懸液，貼在涂有待抑制4種致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌）平板上，28 ℃倒置培養24 h（厭氧菌培養72 h），觀察有無抑菌圈及抑菌圈大小。

1.2.6 氨氮含量測定試驗 取適當稀釋的菌懸液0.1 mL涂布在氨氮篩選培養基平板上，28 ℃倒置培養24 h，觀察菌種生長情況。選取能夠在氨氮篩選固體培養基中生長的菌種，并取其菌懸液0.5 mL接種于20 mL的氨氮測定培養基的100 mL三角瓶中，28 ℃、120 r·min-1振蕩培養（C22 28 ℃厭氧靜置培養）24 h。菌液適當稀釋后測定氨氮含量，氨氮測定方法為次溴酸鹽氧化法（參照GB 17378.4—2007）。

1.2.7 亞硝酸氮含量測定試驗 取0.5 mL活化好的不同菌種，分別接種于20 mL的亞硝酸氮測定培養基1和2的100 mL三角瓶中，于28 ℃、120 r·min-1振蕩培養（C22于28 ℃厭氧靜置培養）24 h，適當稀釋后測定菌液濃度OD600和菌液的亞硝酸氮含量。亞硝酸氮測定方法為萘乙二胺分光光度法。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌生長的測定

從圖1可知，C22為厭氧菌，生長情況較差，其余菌種生長情況良好。其中：C24在24 h的菌液濃度最大，生長情況最好；C15前期生長較差，24 h生長旺盛；C10-2、C12、C13和C23前后菌濃度差別不大。

2.2 不同芽孢桿菌酶活能力的測定

如表1所示：所有菌種都有分泌蛋白酶的能力，C22分泌蛋白能力較差；從產淀粉酶的能力來看，C15、C22產淀粉酶能力非常弱，無法看到淀粉水解的透明圈，其余菌種都有較強的淀粉水解能力；從產卵磷脂酶的能力來看，C23、C24產卵磷脂能力很強，C10-2、C12和C13產卵磷脂酶能力次之，C22對卵磷脂的降解能力較小，C15不產生卵磷脂酶。

2.3 不同芽孢桿菌的耐鹽性試驗

如表2所示，在耐鹽性試驗中，除了C24試驗組（含3%NaCl）的生長情況好于對照組（含0.5%NaCl）之外，其余菌種在對照組中的生長情況好于試驗組，C22的生長情況較其余菌種的生長濃度小的多。

2.4 不同芽孢桿菌的耐堿性試驗

如表3所示，在耐堿性試驗中，對照組（普通牛肉膏蛋白胨培養基）的生長情況很好，試驗組（pH10的牛肉膏蛋白胨培養基）基本沒有生長，C22的生長結果在兩組均較差。

2.5 不同芽孢桿菌的抑菌試驗

抑菌試驗結果：7個菌種對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌沒有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌結果如表4所示。

在金黃色葡萄球菌的抑菌試驗中，可以看出C10-2、C12和C13的抑菌效果較好，C22、C23和C24的抑菌效果稍差一些，C15沒有抑菌效果。

2.6 不同芽孢桿菌的氨氮降解試驗

7種芽孢桿菌在氨氮篩選平板上均有菌落出現，表明這7種芽孢桿菌都能以NH4Cl作為氮源生長，具有去除氨氮的能力，需要對其去除氨氮能力進行定量測定。試驗結果顯示（表5）：不同菌種培養24 h均有良好的生長；經過24 h的培養，不同菌種對氨氮的降解率均達到50%以上，其中C12、C22、C23和C24對氨氮降解率可以達到70%。

2.7 不同芽孢桿菌的亞硝酸氮降解試驗

如表6所示，不同菌種經過24 h培養后，菌種均有生長，但生長濃度不高；亞硝酸氮的降解率最好的是C22，達到64.4%，C13的亞硝酸降解率最差，其余菌種的降解率均不高。

3 結論與討論

有許多研究表明，芽孢桿菌具有降低氨氮和大分子有機物的能力，枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌具有明顯的去除氨氮和亞硝酸氮的功能，利用枯草芽孢桿菌制劑改良羅氏沼蝦養殖池塘水質，氨氮最大降解率為59.61%，亞硝態氮的最大降解率為86.70%，地衣芽孢桿菌可以有效地分解殘餌中的蛋白質和淀粉；芽孢桿菌還可促進微藻、顫藻等有益藻類的生長，抑制嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌等水產致病菌的繁殖擴散[11-12]。此外，芽孢桿菌對養殖動物還有益生作用，像一些短小芽孢桿菌可以作為水產動物的促生長添加劑，添加芽孢桿菌的飼料可以更明顯地提升其在養殖動物腸道中的作用。例如在飼料中添加枯草芽孢桿菌，可以顯著提高宿主腸道內消化酶的活性，增加腸道中有益菌群（如雙歧桿菌和乳桿菌）的數量。芽孢桿菌的種類繁多、功能各異，是目前在水產養殖中應用最普遍，使用數量最多的菌種，其研究與發展前景十分廣闊。endprint

本試驗對從不同種市售芽孢桿菌產品中提取分離得到的7株芽孢桿菌進行分類篩選，發現芽孢桿菌C24在基本培養基和高鹽的培養基中均能旺盛生長，分泌胞外酶，對氨氮的降解率均達到75%以上，并且同時具有降低亞硝態氮的能力，說明其生長速度快，有一定的抗逆性，能有效去除水中氨氮，可作為高效氨氮降解的水產試驗菌種。C22作為試驗中唯一的厭氧菌，生長速度緩慢，菌液濃度偏低，所表現出的酶活力、抑菌能力也較差，但在亞硝酸氮的降解試驗中，對亞硝酸氮的降解率明顯高于其他菌種，達到64.4%，可作為有效去除亞硝態氮的水產試驗菌種。C12和C13生長迅速，產蛋白酶、淀粉酶能力較強，可作為水體有機質降解的水產試驗菌株。本次試驗中得到的芽孢桿菌，雖然在去除氨氮，亞硝酸氮和有機物的降解等方面作用具有可行性，但其在應用實際生產中的降氨效果與有機物分解效率還需進一步研究。

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