水貂源乳桿菌及雙歧桿菌的分離鑒定

張璐++郭榮++劉慧++王志強(qiáng)++韓先杰++溫建新

摘 要：取健康水貂糞便樣經(jīng)過處理后用MRS、TPY選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選出主要優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌和雙歧桿菌。對(duì)所篩選出的乳桿菌和雙歧桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)鑒定和PCR鑒定。結(jié)果表明，乳桿菌和雙歧桿菌為革蘭氏陽性菌，糖醇發(fā)酵試驗(yàn)為陽性，并能抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，但對(duì)沙門氏菌無抑制作用。乳桿菌PCR鑒定中，在230 bp處有特異性條帶，雙歧桿菌在260 bp處有特異性條帶。此試驗(yàn)為水貂專用微生態(tài)制劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水貂；乳桿菌；雙歧桿菌；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：S85 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.05.009

Isolation and Identification of the Lactobacillaceae and Bifidobacterium from Mink

ZHANG Lu， GUO Rong， LIU Hui， WANG Zhiqiang， HAN Xianjie， WEN Jianxin

（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University ， Qingdao，Shandong 266109，China）

Abstract：In this experiment dominant bacteria Lactobacillus and Bifidobacterium were screened in stool samples from healthy mink treated with MRS， TPY selective medium. The screening of Lactobacillus and Bifidobacterium were identified through isolation and culture， biochemical tests and PCR methods.The results showed that Lactobacillus and Bifidobacterium are gram-positive bacteria， the result of sugar alcohol fermentation test is positive， and they could inhibit the growth of E. coli， but had no effect on Salmonella. During PCR identification Lactobacillus has specific bands in 230 bp， Bifidobacterium has specific bands in 260 bp. This experiment laid a solid foundation for mink dedicated probiotics development.

Key words：mink； Lactobacillaceae； Bifidobacterium； separation； identification

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于水貂養(yǎng)殖用微生態(tài)制劑的研究較少，且大多局限于應(yīng)用效果方面，而且缺少毛皮動(dòng)物專用的微生態(tài)制劑。為改善和提高毛皮動(dòng)物的抗病能力，提高繁殖性能和生產(chǎn)性能，最大程度地提高經(jīng)濟(jì)效益，本試驗(yàn)對(duì)從健康水貂糞便中分離的乳桿菌和雙歧桿菌等菌種進(jìn)行鑒定，以期為毛皮動(dòng)物微生態(tài)制劑的研制開發(fā)奠定基礎(chǔ)[1]。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源 健康水貂的糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、改良MC培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）、TPY瓊脂培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、MRS培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.1.3 主要試劑 革蘭氏染色液試劑盒（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）、三糖鐵瓊脂、糖或醇發(fā)酵管（蜜二糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、木糖、山梨醇）、MR試劑、VP試劑、淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基、吲哚培養(yǎng)基、明膠液化試驗(yàn)培養(yǎng)基、硫化氫、尿素酶。

1.2 分離純培養(yǎng)

稱取新鮮水貂糞便樣10 g，放入盛90 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，振搖約10 min，使之充分散開。靜置后取5 mL上清液移于10 mL離心管中，此為10-1稀釋液。用移液槍吸取10-1稀釋菌懸液200 μL，滴于培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻，室溫下靜置5 min，將平板倒置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h。

長(zhǎng)出菌落后，挑取疑似單菌落，依次接種于改良MC培養(yǎng)基、TPY瓊脂培養(yǎng)基、含碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基各3個(gè)，TPY瓊脂培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)罐中，將所有平板于37 ℃恒溫箱中進(jìn)行純培養(yǎng)，培養(yǎng)18 h，觀察結(jié)果[2]。

1.3 革蘭氏染色

對(duì)菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，記錄結(jié)果。

1.4 生化鑒定

1.4.1 常規(guī)生化試驗(yàn) 分別挑取乳桿菌和雙歧桿菌菌落，對(duì)菌落進(jìn)行糖或醇的發(fā)酵試驗(yàn)（蜜二糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、木糖、山梨醇）、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、KOH試驗(yàn)[3]。

1.4.2 耐酸性試驗(yàn) 配制營(yíng)養(yǎng)肉湯，用注射器吸取5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯注入試管中，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0（對(duì)照），并做好標(biāo)記。 將各pH值培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min后備用。