STAT-1對白介素1β誘導的關節軟骨細胞衰老的影響及其可能機制研究

馮 欣，李 垚

121000遼寧省錦州市，遼寧醫學院附屬第一醫院風濕免疫科(馮欣)；遼寧醫學院生理學教研室(李垚)

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STAT-1對白介素1β誘導的關節軟骨細胞衰老的影響及其可能機制研究

馮 欣，李 垚

121000遼寧省錦州市，遼寧醫學院附屬第一醫院風濕免疫科(馮欣)；遼寧醫學院生理學教研室(李垚)

【摘要】目的探討STAT-1對白介素1β(IL-1β)誘導的關節軟骨細胞衰老的影響及可能機制。方法軟骨細胞同步化后分為：正常對照組(正常培養的軟骨細胞)；IL-1β組(加入IL-1β，濃度為10 ng/ml)；陰性對照組(加入IL-1β和空白質粒)；STAT-1轉染組(加入IL-1β和siRNA-STAT-1重組質粒)。檢測各組細胞的β-半乳糖苷酶染色陽性率；采用MTT法檢測4組細胞培養24、48、72 h時的增殖情況；Western blotting法檢測4組細胞STAT-1蛋白的表達水平；采用端粒酶檢測試劑盒進行端粒酶活性測定。結果細胞培養24 h時，各組細胞的增殖率比較，差異無統計學意義(F=3.037，P=0.087)。細胞培養48 h和72 h時，各組細胞的增殖率比較，差異均有統計學意義(F=3.754，P<0.05；F=3.871，P<0.05)；其中IL-1β組、陰性對照組細胞增殖率均分別低于正常對照組、STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)。正常對照組β-半乳糖苷酶染色陽性率為(12.11±1.34)%，IL-1β組為(65.62±2.56)%，陰性對照組為(60.73±3.21)%，STAT-1轉染組為(21.32±2.21)%，4組細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率比較，差異有統計學意義(F= 2.877，P<0.05)；其中IL-1β組和陰性對照組均高于正常對照組和STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)。4組STAT-1表達水平比較，差異有統計學意義(F=236.150，P<0.05)；其中IL-1β組和陰性對照組STAT-1表達水平均高于正常對照組和STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)。正常對照組端粒酶活性為(81.65±5.28)%，IL-1β組為(60.32±5.32)%，STAT-1轉染組為(76.76±3.45)%。3組端粒酶活性比較，差異有統計學意義(F=26.040，P<0.05)；其中IL-1β組端粒酶活性低于正常對照組和STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論STAT-1在IL-1β誘導的衰老關節軟骨細胞中表達水平升高，可能通過影響端粒酶活性而參與軟骨細胞的衰老。

【關鍵詞】骨關節炎；STAT-1；白介素1β;端粒酶;細胞衰老

馮欣，李垚.STAT-1對白介素1β誘導的關節軟骨細胞衰老的影響及其可能機制研究[J].中國全科醫學，2016，19(11)：1310-1313.[www.chinagp.net]

Feng X，Li Y.Influence of STAT-1 on articular cartilage cells senescence induced by IL-1β and the possible mechanism[J].Chinese General Practice，2016，19(11)：1310-1313.

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是由多種原因引起的關節軟骨的非炎癥性退行性變，表現為關節疼痛、活動受限，最終可導致關節畸形和功能障礙[1]。OA患病率隨著年齡增長而增加，隨著人口老齡化，OA已經成為極常見的疾病，是備受關注的醫療和社會問題。

OA最基本的病理改變為關節軟骨的退行性變和消失，而軟骨細胞的衰老是其重要的分子機制。JAK/STAT通路是參與細胞衰老發病過程的一條重要的信號轉導通路，JAK/STAT通路參與了多種細胞的衰老，而在軟骨細胞衰老中的作用尚不清楚。為此，本實驗首先研究STAT-1在白介素1β(IL-1β)誘導的衰老的關節軟骨細胞中的表達水平，明確STAT-1在衰老的關節軟骨細胞中的表達變化，進一步應用STAT-1的沉默載體，轉染入關節軟骨細胞，檢測細胞衰老指標的變化，探討STAT-1對關節軟骨細胞衰老的影響及可能機制。

1材料與方法

1.1材料與試劑大鼠關節軟骨細胞(購自上海博慧斯公司)；低糖DMEM培養基(Gibco公司，美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT(Sigma公司，美國)；兔抗大鼠STAT-1多克隆抗體(santa cruz公司)；HRP-標記的羊抗兔二抗(中杉公司)；β-半乳糖苷酶染色試劑盒(上海杰美基因有限公司)；端粒酶活性檢測試劑盒(德國Roche Diagnostics公司)。

1.2實驗方法

1.2.1軟骨細胞培養及分組軟骨細胞在37 ℃ 5% CO2，DMEM(含糖5.5 mmol/L)培養液中培養至亞融合(70%～80%)狀態后，換無血清DMEM培養液，繼續培養24 h，使細胞同步化后分為：正常對照組(正常培養的軟骨細胞)；IL-1β組(加入IL-1β，濃度為10 ng/ml)；陰性對照組(加入IL-1β和空白質粒)；STAT-1轉染組(加入IL-1β和siRNA-STAT-1重組質粒)。

1.2.2STAT-1沉默載體表達的構建設計并合成能夠特異性抑制STAT-1基因的RNAi序列，將其克隆入RNAi載體pGenesil，獲得pGenesil-siRNA-STAT-1重組載體，脂質體法轉染關節軟骨細胞。

1.2.3β-半乳糖苷酶染色各組細胞培養至48 h后，PBS洗滌3次，室溫固定細胞5 min(固定液配方：2%甲醛，0.2%戊二醛)，PBS洗滌3次后，加上新配制的1 ml衰老相關的β-半乳糖苷酶染液，置于37 ℃(無CO2)溫育12～16 h，觀察細胞胞質中藍色沉淀，并于每個樣本隨機選擇6個視野，計數陽性細胞百分數。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖率各組細胞接種于96孔板，同步化后，在培養24、48、72 h后分別測細胞增生率。采用MTT法：培養結束后加入MTT(5 g/L)20 μl，于37 ℃培養箱孵育4 h后，吸去MTT液，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)200 μl，用水平搖床搖勻震蕩10 min，用酶標儀觀察，在490 nm波長處記錄各組吸光度值。細胞增生率=(IL-1β組吸光度值-實驗組吸光度值/IL-1β組吸光度值)×100%。

1.2.5軟骨細胞中STAT-1的表達Western blotting法：各組細胞培養至48 h后，用RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃離心(以12 000×g，離心5 min)，取上清液，BCA法測定蛋白濃度后，制成蛋白濃度相等的樣品。8%聚丙烯酰胺凝膠上垂直電泳。電轉印至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入STAT-1多克隆抗體(1∶1 000)，孵育過夜。洗膜后抗孵育過夜。二抗室溫孵育2 h。堿性磷酸酶法顯色。成像分析掃描儀掃描成像，Scinn Corporation分析軟件進行灰度值半定量分析，待測蛋白與相應actin的條帶灰度比值表示待測蛋白的相對含量。實驗重復3次，取算術平均值進行統計分析。

1.2.6端粒酶活性測定各組細胞培養至48 h后，采用端粒酶檢測試劑盒進行端粒酶活性測定。向裝有反應液的PCR管中加入1 μl待測細胞裂解懸液，混勻，向PCR管中加入引物1 μl Tag酶混勻，滴加一滴石蠟油混勻，離心數秒，于30 ℃放置30 min，然后進行PCR擴增：進行35個循環，94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s。最后72 ℃保溫5 min。PCR產物經12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過檢測端粒酶合成的6 bp端粒DNA片段產物表示端粒酶活性表達。

2結果

2.1細胞增殖率細胞培養24h時，各組細胞的增殖率比較，差異無統計學意義(F=3.037，P=0.087)。細胞培養48h和72h時，各組細胞的增殖率比較，差異均有統計學意義(F=3.754，P<0.05；F=3.871，P<0.05)；其中IL-1β組、陰性對照組細胞增殖率均分別低于正常對照組、STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖1)。

注：IL-1β=白介素1β

圖1不同時刻各組細胞增殖率

Figure1Cellproliferationofdifferentgroupsatdifferenttimepoints

2.2β-半乳糖苷酶染色陽性率比較正常對照組β-半乳糖苷酶染色陽性率為(12.11±1.34)%，IL-1β組為(65.62±2.56)%，陰性對照組為(60.73±3.21)%，STAT-1轉染組為(21.32±2.21)%。4組細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率比較，差異有統計學意義(F= 2.877，P<0.05)；其中IL-1β組和陰性對照組均高于正常對照組和STAT-1轉染組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3STAT-1表達水平比較4組STAT-1表達水平比較，差異有統計學意義(F=236.150，P<0.05)；其中IL-1β組和陰性對照組STAT-1蛋白表達水平均高于正常對照組和STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖2、3)。

注：1=正常對照組，2=IL-1β組，3=陰性對照組，4=STAT-1轉染組

圖2各組STAT-1表達電泳圖

Figure2ProteinelectrophoresiofSTAT-1ofeachgroup

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與STAT-1轉染組比較，bP<0.05

圖3各組細胞STAT-1表達水平比較

Figure3CompasisonofSTAT-1proteinexpressionlevelamongeachgroup

2.4端粒酶活性比較正常對照組端粒酶活性為(81.65±5.28)%，IL-1β組為(60.32±5.32)%，STAT-1轉染組為(76.76±3.45)%。3組端粒酶活性比較，差異有統計學意義(F=26.040，P<0.05)；其中IL-1β組端粒酶活性低于正常對照組和STAT-1轉染組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

3討論

OA是臨床常見的關節病，是由于老年或其他原因如創傷、先天性異常等引起關節軟骨的非炎癥性退行性變及關節邊緣骨贅形成。本病可累及多個關節，臨床上可出現關節疼痛、活動受限，最終導致關節畸形和功能障礙。OA可從20歲開始就可以發病，患病率隨著年齡增長而增加。50歲以上人群中，OA的發病率為50%，55歲以上的人群中，發病率為80%。我國OA的發病情況約占總人口的10%，約為1億人。隨著人口老齡化，OA已經成為常見疾病。由于關節畸形和功能障礙，嚴重影響患者的身體健康和生活質量，給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔。OA已經成為備受關注的醫療和社會問題[2]。

OA的病因及發病機制至今尚未完全明確，目前認為其最基本的病理改變為軟骨的退行性變和消失，導致軟骨基質降解、軟骨細胞死亡和關節完整性破壞。軟骨細胞是成熟軟骨組織內唯一的細胞類型，近年研究顯示，軟骨細胞過度凋亡和衰老可能對OA的發病產生了重要影響[3-4]。

IL-1β被廣泛認為是調控OA機制的關鍵因子，其調節蛋白水解酶、細胞因子、一氧化氮(NO)、前列腺素和其他遞質及組織炎性效應物的合成，驅動軟骨損傷。已有研究證實，IL-1β能誘導關節軟骨細胞發生退變[5]。本研究結果顯示，應用IL-1β刺激軟骨細胞48h后，與正常對照組相比，IL-1β組細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率明顯升高，MTT結果顯示，IL-1β使細胞的增殖明顯下降，提示IL-1β成功地誘導了關節軟骨細胞發生衰老。

近年來越來越多的研究及證據表明，信號通路在調控衰老的起始和持續中起重要作用，細胞衰老后，多種激酶和轉錄因子被激活，涉及多種細胞內信號轉導通路，并在多層次和諸多環節存在交互作用。JAK/STAT通路是參與細胞衰老發病過程的一條重要的信號轉導通路，STATs家族是一種能與DNA結合的蛋白家族，哺乳動物細胞STAT家族成員主要包括STAT-1、STAT-2、STAT-3(α/β/γ)、STAT-4、STAT-5(A/B)和STAT-6。STAT-1是第一個被發現的STAT，其參與細胞的生長，可促進細胞的凋亡。STAT-1在不同衰老細胞中的表達也不一致，例如：STAT-1和P-STAT1在被干擾素誘導衰老大鼠的巨噬細胞中減少[6]；在血管緊張素Ⅱ誘導衰老人腎小球系膜細胞中STAT-1的表達水平升高[7]，而STAT-1在衰老的關節軟骨細胞中表達如何變化國內外尚未見報道。本實驗檢測了在衰老的關節軟骨細胞中STAT-1表達水平，結果顯示：與對照組比較，IL-1β組STAT-1表達水平明顯升高，提示STAT-1可能參與關節軟骨細胞衰老的發生。在此基礎上，進一步應用STAT-1的沉默載體轉染入軟骨細胞，結果顯示轉染組細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率較IL-1β組明顯降低，提示降低STAT-1可能減輕軟骨細胞的衰老。

細胞衰老可能涉及多種學說，而細胞端粒長度的縮短是重要機制之一。端粒是真核細胞染色體末端的特殊的DNA/蛋白質復合物，能防止染色體被降解、融合、重組或形成不穩定結構，從而維護染色體的完整性和穩定性[8]。端粒自身則會隨著細胞有絲分裂的進行而逐漸縮短。當端?？s短到一定程度時，染色體就會變得不穩定，細胞就不再分裂，所以端?？s短是細胞衰老的直接原因[9]。已有研究報道：關節軟骨細胞端粒長度的縮短會導致OA的發生發展[10]。端粒的長度調節主要是通過端粒酶來維持，端粒酶是一個自身攜帶模板的反轉錄酶，可以延長端粒重復序列，從而使細胞應對分裂后染色體末端縮短問題。本實驗進一步應用STAT-1的沉默載體，轉染入衰老的關節軟骨細胞，檢測衰老細胞的端粒酶活性的變化，結果顯示，STAT-1轉染組細胞端粒酶活性較IL-1β組明顯升高，提示STAT-1通過調節端粒酶的活性參與關節軟骨細胞衰老的發生。

綜上所述，STAT-1在IL-1β誘導的衰老關節軟骨細胞中表達升高，轉染STAT-1的沉默載體后，軟骨細胞的衰老減輕并且端粒酶活性升高。本實驗明確STAT-1對衰老的關節軟骨細胞的調節效果和可能機制，為進一步闡明關節軟骨細胞衰老的分子機制及其防治提供了一條新的思路和靶點。

作者貢獻：馮欣進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；馮欣、李垚進行實驗實施、評估、資料收集；馮欣進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

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(本文編輯：賈萌萌)

Influence of STAT-1 on Articular Cartilage Cells Senescence Induced by IL-1β and the Possible Mechanism

FENGXin，LIYao.

DepartmentofRheumatology，theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity，Jinzhou121000，China

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of STAT-1 on articular cartilage cellular senescence induced by IL-1β and the possible mechanism.MethodsAfter the synchronization of articular cartilage cells，they were divided into four groups：normal control group(cartilage cells normally cultured)，IL-1β group (IL-1β was added with an concentration of 10 ng/ml)，negative control group(IL-1β and empty plasmid were added) and STAT-1 transfection group(IL-1β and siRNA-STAT-1 recombinant plasmid were added).The positive rate of β-galactosidase staining of each group was detected；MTT method was adopted to observe the cell proliferation of the four groups at 24，48 and 72 h of cell culture；Western blotting method was used to detect the STAT-1 protein expression of the four groups；telomerase detection kit was used to determine telomerase activity.ResultsAt 24 h of cell culture，the four groups were not significantly different in proliferation level(F=3.037，P=0.087).The four groups were significantly different in the proliferation among each group at 48 h and 72 h of cell culture(F=3.754，P<0.05；F=3.871，P<0.05)；IL-1β group and negative control group were lower than normal control group and STAT-1 transfection group in cell proliferation level(P<0.05).The positive rate of β-galactosidase staining was(12.11±1.34)% for normal control group，(65.62±2.56)% for IL-1β group，(60.73±3.21)% for negative control group and(21.32±2.21)% for STAT-1 transfection group.The four groups were significantly different in the positive rate of β-galactosidase staining(F= 2.877，P<0.05)；IL-1β group and negative control group were higher than normal control group and STAT-1 transfection group in the positive rate(P<0.05).The four groups were significantly different in STAT-1 protein expression level(F=236.150，P<0.05)；IL-1β group and negative control group were higher than normal control group and STAT-1 transfection group in the expression level(P<0.05).The telomerase activity was (81.65±5.28)% for normal control group，(60.32±5.32)% for IL-1β group and(76.76±3.45)% for STAT-1 transfection group.The three groups were significantly different in telomerase activity(F=26.040，P<0.05)；IL-1β group was lower than normal control group and STAT-1 transfection group in telomerase activity(P<0.05).ConclusionThere is higher STAT-1 protein level in the articular cartilage cellular senescence induced by IL-1β.STAT-1 may participate in the articular cartilage cells senescence by influencing telomerase activity.

【Key words】Osteoarthritis；STAT-1；Interleukin-1 β;Telomerase;Cell aging

(收稿日期：2015-10-13；修回日期：2015-12-18)

【中圖分類號】R 684.3

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.017

通信作者：馮欣，121000遼寧省錦州市，遼寧醫學院附屬第一醫院風濕免疫科；E-mail：xinxinyiran@126.com

基金項目：2015年遼寧省自然科學基金資助項目(2015020356)