X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡及Survivin蛋白表達(dá)的影響

任振泰　王曉瑜

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 放療科　河南 鄭州　450052)

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X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡及Survivin蛋白表達(dá)的影響

任振泰王曉瑜

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 放療科河南 鄭州450052)

【摘要】目的分析X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡及Survivin蛋白表達(dá)的影響。方法將BGC-803胃癌細(xì)胞分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組；實(shí)驗(yàn)組分別給予1、2、5 Gy X射線照射。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡及Survivin蛋白表達(dá)情況。結(jié)果隨著X射線劑量增大，BGC-803細(xì)胞凋亡率增大；在2 Gy、5 Gy組，隨X射線照射時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率增大，而1 Gy組無明顯改變。大劑量(5 Gy)X射線引起B(yǎng)GC-803胃癌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)增加，而小劑量X射線(1 Gy、2 Gy組)對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)無顯著影響。結(jié)論X線輻射引起B(yǎng)GC-803胃癌細(xì)胞凋亡具有輻射劑量、時(shí)間依賴性；大劑量X射線照射使Survivin蛋白表達(dá)增加，可能與細(xì)胞周期、DNA同源重組修復(fù)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃癌；X射線；Survivin蛋白

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)發(fā)病數(shù)及死亡數(shù)均位于第3位[1]。手術(shù)是胃癌的主要治療手段。早診斷、早手術(shù)是有效提高患者預(yù)后的因素[2]，晚期胃癌的5年生存率很低[3]。局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是胃癌術(shù)后失敗的主要原因。為提高胃癌治療療效，圍手術(shù)期綜合治療顯得尤為重要，單純或者輔助放射治療越來越受到重視。Survivin基因作為凋亡抑制家族的一員，主要作用為抑制細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖、促進(jìn)血管生成等[4-8]。Survivin蛋白特異性高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良呈正相關(guān)。有研究認(rèn)為，其高表達(dá)與放射治療敏感性也有關(guān)系[9]。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞X線外照射，觀察細(xì)胞凋亡、Survivin 蛋白表達(dá)情況，并分析它們之間的關(guān)系，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑BGC-803胃癌細(xì)胞購(gòu)于協(xié)和細(xì)胞室，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司， 兔IgG多抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊血清購(gòu)自中國(guó)北京中杉公司，碘化丙啶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(照射劑量1、2、5 Gy)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-803胃癌細(xì)胞懸液接種到24孔板，細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h，室溫下進(jìn)行X射線垂直照射，不同組照射劑量分別為1、2、5 Gy。放射線照射后分別于0、2、4、6 h終止培養(yǎng)。

1.2.1照射方法采用美國(guó)Varian Clinac 23EX直線加速器，6MV-X線照射，源皮距100 cm，劑量率3 Gy/min，1.5 cm組織補(bǔ)償膠遮擋。

1.2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)終止培養(yǎng)后去培養(yǎng)液，以0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打混勻形成單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次(離心2 000 rpm，5 min)，后配置成濃度為5×105cell/ml的單細(xì)胞懸液，將懸液移液至離心管，1 000 rpm，4 ℃離心10 min，棄上清；加入500 μl的Binding Buffer，輕輕吹打混勻?yàn)榛鞈壹?xì)胞液；加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻；加入5 μl PI，混勻；室溫下避光反應(yīng)，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。獨(dú)立重復(fù)3次。用Modfit軟件分析細(xì)胞凋亡，結(jié)果以百分率表示。

1.2.3Survivin蛋白檢測(cè)終止培養(yǎng)后去培養(yǎng)液，以0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打混勻形成單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次(離心2 000 rpm，5 min)，后配置成濃度為5×105cell/ml的單細(xì)胞懸液。特異組加Survivin兔IgG多抗50 μl(非特異組加50 μl PBS)，4 ℃條件下作用45 min；加入封閉山羊血清50 μl，4 ℃反應(yīng)30 min，PBS洗滌2次；加入FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG 50 μl，4 ℃反應(yīng)45 min。PBS洗滌兩次后上機(jī)檢測(cè)，利用Cell Quest軟件分析。Survivin蛋白表達(dá)=特異組陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)-非特異組陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)。獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 15.0數(shù)據(jù)分析軟件包完成數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本均數(shù)的比較使用One-Way ANOVA。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡的影響1 Gy照射組細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4 h與6 h時(shí)間點(diǎn)隨X射線劑量增大，BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡率增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨觀察時(shí)間延長(zhǎng)，2 Gy組及5 Gy組細(xì)胞凋亡率增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡率具有輻射劑量、時(shí)間依賴性。見表1。

表1　X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞凋亡率的影響

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與1 Gy組、2 Gy組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP<0.01；組內(nèi)與0 h及2 h時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.01。

2.2X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響小劑量(1、2 Gy)X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)無影響(P>0.05)；大劑量(5 Gy)X射線引起B(yǎng)GC-803胃癌細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。見表2。

表2　 X射線對(duì)BGC-803胃癌細(xì)胞Survivin

注：與對(duì)照組、1 Gy組、2 Gy組比較，dP<0.01；組內(nèi)與0 h時(shí)間點(diǎn)比較，eP<0.01。

3討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)生是受多因素影響的復(fù)雜病理過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻。臨床確診時(shí)，大部分胃癌已經(jīng)處于進(jìn)展期。對(duì)于進(jìn)展期或術(shù)后復(fù)發(fā)患者，沒有特效治療方案，預(yù)后較差。腫瘤細(xì)胞的過度增生、凋亡抑制在胃癌惡化進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。如何控制胃癌惡化進(jìn)展已經(jīng)成為臨床亟待解決的問題。Survivin基因在胃癌組織中高表達(dá)已得到證實(shí)，而正常胃黏膜組織無表達(dá)[10]。Survivin作為凋亡抑制因子，其高表達(dá)預(yù)示著癌癥進(jìn)展以及預(yù)后不良，影響了放射治療的敏感性[11-12]。研究細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)與放射治療以及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，對(duì)于指導(dǎo)惡性腫瘤的治療具有重要意義。

本研究中，不同劑量X射線照射BGC-803胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率具有劑量、時(shí)間依賴性，表現(xiàn)為隨照射劑量增大、時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率增大。大劑量(5 Gy)X射線輻射BGC-803胃癌細(xì)胞引起Survivin蛋白表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)表明，X線輻射導(dǎo)致BGC-803胃癌細(xì)胞高凋亡率的同時(shí)伴有Survivin蛋白高表達(dá)。考慮以下原因：放射生物學(xué)認(rèn)為，有絲分裂期細(xì)胞或接近有絲分裂期，即G2/M期細(xì)胞是放射最敏感細(xì)胞，易引起輻射凋亡[13]；在整個(gè)細(xì)胞周期中Survivin蛋白高表達(dá)主要在G2期或者Survivin使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；Survivin蛋白高表達(dá)G2期BGC-803胃癌細(xì)胞，容易引起輻射誘導(dǎo)的凋亡。染色體DNA是X射線輻射引起細(xì)胞凋亡的靶位；DNA受到輻射損傷，特別是亞致死性損傷后，具有自我損傷修復(fù)能力；高表達(dá)的Survivin蛋白抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中凋亡率與Survivin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，考慮Survivin基因與DNA損傷后的同源重組修復(fù)有關(guān)[14]。

放射生物學(xué)認(rèn)為，放射敏感腫瘤常常是低分化、高惡性腫瘤，受到輻射后易引起輻射凋亡[13]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Survivin蛋白高表達(dá)容易輻射凋亡。但是艾秀清等[12]通過臨床實(shí)驗(yàn)提示，Survivin蛋白低表達(dá)增加了放射治療的敏感性，Survivin蛋白高表達(dá)組細(xì)胞凋亡指數(shù)低。這與本研究以及經(jīng)典的放射生物學(xué)理論不同。這種差異考慮以下原因：體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)標(biāo)本差異；放射治療前的化療對(duì)Survivin蛋白表達(dá)有影響；本研究觀察終止時(shí)間為X線輻射后6 h；細(xì)胞受到輻射后喪失克隆能力，進(jìn)行有限的幾次有絲分裂，高表達(dá)Survivin蛋白參與了損傷修復(fù)、抑制凋亡。具體原因需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，X線輻射引起B(yǎng)GC-803胃癌細(xì)胞凋亡具有輻射劑量、時(shí)間依賴性，伴有Survivin蛋白高表達(dá)，可能與細(xì)胞周期、同源重組修復(fù)有關(guān)，為下一步實(shí)驗(yàn)或者探討二者機(jī)制提供了方向。

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Effects of X-ray on apoptosis of BGC-803 gastric cancer cell and expression of Survivin protein

Ren Zhentai, Wang Xiaoyu

(DepartmentofRadiotherapy,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of X-ray on apoptosis of BGC-803 gastric cancer cells and expression of Survivin protein. MethodsThe BGC-803 gastric cancer cells were divided into control group and experimental groups(radiation doses were 1、2、5 Gy, respectively). Apoptosis of BGC-803 gastric cancer cells and expression of Survivin protein were detected by flow cytometry. ResultsThe apoptosis rate of BGC-803 cancer cells was increased accompanied by the increase of X-ray dose. The apoptosis rate of BGC-803 cancer cells in 2、5 Gy groups was increased with the passage of time, but there was no chage in 1 Gy group. Low dose(1、2 Gy) of X-ray had no effect on the expression of Survivin protein, but 5 Gy group had increased the expression. ConclusionThe apoptosis of BGC-803 cancer cells was induced by X-ray in a dose- and time-dependent manner. High dose X-ray increased the expressiong of Survivin protein. It may be associated with DNA repair by homologous recombination or cell cycle.

【Key words】gastric cancer; X-ray; survivin proteitn

(收稿日期：2015-12-28)

【中圖分類號(hào)】R 735.2

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.004

通訊作者：任振泰，E-mail：rdf_zzu@126.com。