急性腦梗死超早期血液生物標志物β-actin的表達及臨床意義

張亞萍，王斌達，劉春艷，葉指南，唐維國，吳舟娜，何松彬（溫州醫科大學附屬舟山醫院　神經內科，浙江　舟山　316000）

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急性腦梗死超早期血液生物標志物β-actin的表達及臨床意義

張亞萍，王斌達，劉春艷，葉指南，唐維國，吳舟娜，何松彬
（溫州醫科大學附屬舟山醫院神經內科，浙江舟山316000）

[摘 要]目的：探討急性腦梗死超早期（發病＜6 h）血液β-actin的表達狀態及臨床意義。方法：收集急性腦梗死患者80例，設立為急性腦梗死組，并且按不同發病時段，分為腦梗死2 h組、腦梗死4 h組、腦梗死6 h組、腦梗死24 h組及腦梗死72 h組，每組16例；并且與非腦梗死組進行對照比較。非腦梗死組包括短暫性腦缺血發作組、腦出血組及健康人群組，每組16例。采用酶聯免疫吸附法檢測血液β-actin的表達狀態，并與臨床病情結合進行分析。結果：①急性腦梗死組的血液β-actin含量為（4.24±2.74）ng/mL，明顯高于非腦梗死組的（2.25±1.65）ng/mL，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，腦梗死2 h組血液β-actin含量與非腦梗死人群各組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；②通過ROC曲線確定血液生物標志物β-actin早期診斷急性腦梗死的截斷值為2.10 ng/mL時，具有較高的靈敏度和一定的特異度；③急性腦梗死組血液β-actin水平與梗死面積大小以及NIHSS評分呈一定相關性。結論：急性腦梗死超早期血液β-actin的表達升高可能是一種實用的血清生物標志物。

[關鍵詞]急性腦梗死；超早期；β-actin；生物標志物

應用血清生物標志物診斷腦梗死、預測神經功能惡化及梗死出血轉化是目前腦血管病的研究熱點。至今為止，還沒有一項生物標志物被國際認可用于腦梗死診斷及臨床應用，尤其在急性超早期腦梗死的診斷方面。前期曾經應用iTRAQ（同位素相對標記與絕對定量）技術對急性腦梗死血清標志物進行了篩選研究，發現血液生物標志物β-actin在急性超早期腦梗死中有較特異的表達。為了驗證這一發現，本項目對80例不同發病時期的急性腦梗死及48例非急性腦梗死血液樣本進行β-actin檢測及分析，以期探索β-actin作為急性腦梗死血液生物標志物的可能性。

1　對象和方法

1.1研究對象 選取2011年1月至2013年1月收治我院神經內科的急性腦梗死患者共80例，其中男48例，女32例，年齡52～83歲，平均（70.88±10.01）歲，作為急性腦梗死組。納入標準：急性前循環腦梗死，診斷符合1996年第四屆腦血管病會議診斷標準[1]，并經CT或MRI確診。急性腦梗死組根據不同發病時間分為5小組：腦梗死2 h組（抽血時間距腦梗死發病2 h）、腦梗死4 h組（抽血時間距腦梗死發病4 h）、腦梗死6 h組（抽血時間距腦梗死發病6 h）、腦梗死24 h組（抽血時間距腦梗死發病24 h）、腦梗死72 h組（抽血時間距腦梗死發病72 h），每組各16例；排除標準：排除急性后循環腦梗死、腦出血、腦外傷及腦腫瘤患者。非腦梗死組分3小組，包括短暫性腦缺血發作組、腦出血組及健康人群組。選取同期收治我院神經內科的短暫腦缺血性發作2 h患者16例為短暫性腦缺血發作組，其中男10例，女6例，年齡53～88歲，平均（71.63±12.75）歲；納入標準：經詳細詢問病史、嚴格的神經系統檢查并由頭顱CT、MRI證實無腦出血及腦梗死，診斷符合1996年第四屆腦血管病會議診斷標準[1]。選取同期腦出血發病2 h患者16例為腦出血組，其中男12例，女4例，年齡49～87歲，平均（67.88±11.02）歲；納入標準：經頭顱CT證實，診斷符合1996年第四屆腦血管病會議診斷標準[1]，美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分與腦梗死2 h組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。排除標準：影像學檢查提示繼發于腦內異常結構的腦出血；6個月內有缺血性腦卒中發作的病史；腦動脈瘤破裂出血；外傷后腦出血；單純腦室出血等。健康人群組選自健康社區志愿者16例，男6例，女10例，年齡5O～81歲，平均（65.14±l1.13）歲。各非腦梗死組與腦梗死組的年齡、性別匹配，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑和儀器：采用actin酶聯免疫試劑盒（由美國BPD公司生產提供），試劑檢測的靈敏度為1 ng/mL。酶聯免疫吸附實驗（EIISA）檢測用儀器為英國產DENLEY-MK-2型全自動酶標分析儀。

1.2.2標本采取：每個病例和對照均采用真空管抽取3 mL周圍靜脈血。采集1次靜脈血3 mL，冰盒取回后4 ℃冰箱靜置1 h，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清分裝后于-80 ℃冰箱保存，待檢。采血時間：腦梗死、腦出血及短暫性腦缺血發作患者為發病各時間點急診就診時，健康人群組為凌晨空腹。

1.2.3檢測方法：采用ELISA法對β-actin進行檢測，檢測時實驗操作及結果報告均嚴格按照試劑盒操作說明書進行。

1.2.4梗死面積分類方法：按Adamas標準梗死面積直徑＞5 cm并累及2個以上大血管供血區，梗死區面積達到20 cm2或累及2個以上解剖部位的梗死定為大面積腦梗死。其余為中、小面積梗死。

1.2.5神經功能缺損程度評定：應用NIHSS進行評定，以發病72 h以內的神經功能缺損程度評定為準。

1.3統計學處理方法 采用SPSS21．0統計軟件對數據進行統計學處理。計量資料用±s表示，2組均數比較采用獨立樣本t檢驗，多個組間比較采用單因素方差分析，相關分析采用Spearman等級相關分析。利用ROC曲線確定最優截斷點，計算ROC曲線下面積、靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1急性腦梗死組與非腦梗死組血液生物標志物β-actin比較 血清生物標志物β-actin在急性腦梗死組的含量明顯高于非腦梗死組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　急性腦梗死組與非腦梗死組比較（±s）

表1　急性腦梗死組與非腦梗死組比較（±s）

與非腦梗死組比：aP＜0.05

組別　例數　β-actin（ng/mL）急性腦梗死組　80　4.24±2.74a非腦梗死組　48　2.25±1.65a

2.2急性腦梗死不同時段分組與非腦梗死分組血液生物標志物β-actin比較 腦梗死發病2 h血液β-actin水平與各對照組比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表2。

2.3血液生物標志物β-actin診斷早期急性腦梗死的靈敏度及特異度分析 通過ROC曲線確定血清生物標志物β-actin診斷急性腦梗死的截斷值為2.10 ng/mL時，診斷腦梗死的靈敏度為83.8%，特異度為62.5%。分組靈敏度腦梗死2 h組為87.5%，腦梗死4 h組為100.0%，腦梗死6 h組為81.3%，腦梗死24 h組為75.0%，腦梗死72 h組為68.8%，見圖1。

表2　急性腦梗死不同時段分組與非腦梗死分組比（±s）

表2　急性腦梗死不同時段分組與非腦梗死分組比（±s）

與短暫性腦缺血發作組比：aP＜0.05；與腦出血組比：bP＜0.05；與健康人群組比：cP＜0.05

組別　例數　抽血時間　β-actin（ng/mL）腦梗死2 h組　16　發病2 h　3.95±1.18abc腦梗死4 h組　16　發病4 h　5.74±3.36cab腦梗死6 h組　16　發病6 h　3.56±2.28cab腦梗死24 h組　16　發病24 h　4.38±2.83bab腦梗死72 h組　16　發病72 h　3.58±3.20cab短暫性腦缺血發作組　16　發病2 h　2.19±1.28cab腦出血組　16　發病2 h　2.02±1.34cab健康人群組　16　凌晨空腹　2.52±2.22cab

圖1　以急性腦梗死組和非腦梗死組為分析人群，將所有可能的切點作為閾值進行靈敏度和特異度計算，作出ROC曲線，曲線下面積為0.746，說明診斷具有一定的準確性

2.4不同范圍腦梗死與血液生物標志物β-actin表達的關系 大面積腦梗死組血液β-actin表達水平比中、小面積腦梗死組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。Spearman等級相關分析顯示血液β-actin水平與不同范圍腦梗死存在一定正相關性（r=0.792，P＜0.05），見表3。

表3　不同范圍腦梗死血液β-actin水平的比較（±s）

表3　不同范圍腦梗死血液β-actin水平的比較（±s）

組別　例數　β -a c t i n （n g / m L）中、小面積腦梗死組　2 9 　3 .4 1 ± 1 .8 9a大面積腦梗死組　5 1 　4 .5 2 ± 1 .7 4a

2.5不同NIHSS評分與血液生物標志物β-actin表達的關系 將急性腦梗死組依據NIHSS評分分為＜5分、5～10分及＞10分組，3組血液β-actin水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。＜5分組與5～ 10分組比，5～10分組與＞10分組比，＜5分組與＞10分組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。Spearman等級相關分析顯示血液β-actin水平與NIHSS評分呈一定相關性（r=0．653，P＜0.05），見表4。

表4　不同范圍腦梗死NIHSS評分與血液β-actin水平的比較（±s）

表4　不同范圍腦梗死NIHSS評分與血液β-actin水平的比較（±s）

與5～10分組比：aP＜0.05；與＞10分組比：bP＜0.05

組別　例數　β-actin（ng/mL）＜5分組　19　2.14±1.37ab5～10分組　35　3.81±1.58bb＞10分組　26　4.79±2.53bb

3　討論

應用血液生物標志物診斷急性腦梗死目前主要有兩個研究方向：①成組生物標志物的應用研究。成組生物標志物的應用可以彌補單一生物標志物的不足，目前有多項成組生物標志物的研究報道[2]。但是在這些成組生物標志物的研究報道中，沒有一項進行過回歸方程式研究以及大范圍多病種的有效性驗證，也沒有提出一項可以在臨床上操作應用的血清學診斷模式[3]。②在更廣范圍內尋找一種或多種新的血液生物標志物來早期診斷急性腦梗死[4]。基于前期應用iTRAQ技術對急性腦梗死血清標志物進行的篩選研究，發現血液生物標志物β-actin在急性超早期腦梗死有較特異的表達。本研究采用ELISA法檢測急性腦卒中患者血液中的β-actin，發現急性腦梗死患者血液β-actin含量明顯高于腦出血組、短暫性腦缺血發作組及健康人群組。

β-actin是腦微血管內皮細胞細胞骨架蛋白的重要構成成分，由跨膜蛋白和胞質附著蛋白組成的連接復合物固定在細胞內，在細胞連接和細胞屏障功能上發揮著重要的作用[5]。β-actin主要有兩種存在形式，包括胞內呈聚合態的F-actin和胞漿中游離態的G-actin，其中F-actin呈纖維狀，是構成細胞骨架的主要部分，G-actin則為單體分子球形蛋白。有研究顯示缺氧/復氧導致血腦屏障通透性增高，同時F-actin、Occludin以及ZO-1的表達量也增加，尤其以F-actin升高最為顯著[6-7]。但也有研究發現在缺氧/低糖對體外模型腦內皮細胞的刺激實驗中，骨架蛋白actin結構發生了改變，但是actin在腦內皮細胞中表達卻是減少的[8]。我們推測這一現象可能與早期急性腦梗死缺血低氧中血腦屏障的通透性發生改變[9-12]，腦微血管內皮細胞因缺血低氧而致細胞膜通透性增加，導致細胞內的β-actin大量釋放入血有關，也可能與血腦屏障的時序開放相關[13]。結合本項研究的觀察結果，有理由認為：血液β-actin的表達升高可能是診斷超早期急性腦梗死的一個生物標志物，且具有較高靈敏度和一定特異度。

本研究還發現，急性腦梗死發病2 h組血液β-actin含量分別與短暫性腦缺血發作、腦出血組比較，差異均有統計學意義。為此我們推測急性腦梗死、短暫性腦缺血發作及腦出血三者在發病2 h時，對血腦屏障的影響是不一樣的。急性腦梗死與短暫性腦缺血發作雖然都是大腦血管的缺血，但是它們的缺血時間不同，所產生的后果也有所不同。一般而言，短暫性腦缺血發作持續時間不超過1 h，如果超過1 h大腦就會出現不可逆的損害，而不可逆的損害發生可能與血腦屏障緊密連接發生不可逆的變化有關。另外，腦出血對血腦屏障的影響可能與血液中凝血酶等因子毒性刺激有關[14]，與急性腦梗死引起的腦血管缺血有所不同。通過分析有理由認為：急性腦梗死2 h時血液β-actin的表達升高可能是一個特征性的變化，這一變化可以有效區分急性腦梗死與短暫性腦缺血發作、腦出血。

其次，我們通過ROC曲線確定血液生物標志物β-actin診斷急性腦梗死的臨界值為＞2.10 ng/mL時，診斷急性腦梗死平均靈敏度為83.8%，特異度為62.5%。其中分組靈敏度以腦梗死2 h組和腦梗死4 h組較高，最高達100.0%。由此說明通過測定血液β-actin水平來發現早期的腦梗死具有較高的靈敏度及一定的特異度。此外，大面積腦梗死患者血液β-actin表達水平比中小面積腦梗死患者高，差異有統計學意義，相關分析示血液β-actin水平與不同面積腦梗死及神經功能缺損程度（NIHSS評分）存在一定的正相關性。急性腦梗死血腦屏障損害相關標志物β-actin，可能是一種實用的急性腦梗死生物標志物。對這一問題的深入研究，將為臨床利用血清生物標志物診斷早期急性腦梗死提供新的思路。

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（本文編輯：吳彬）

·論著·

Expression and clinical significance of ultra early stage biomarker blood β-actin in patient with acute cerebral infarction

ZHANG Yaping,WANG Binda,LIU Chunyan,YE Zhinan,TANG Weiguo,WU Zhouna,HE Songbin.Department of Neurology,Zhoushan Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Zhoushan,316000

Abstract:Objective:To explore the expression level of blood β-actin and its clinical significance in ultra early stage of acute cerebral infarction.Methods:Eighty patients with acute cerebral infarction (ACI) were selected as cerebral infarction group,and they were divided into five subgroups by different periods (2 hours,4 hours,6 hours,24 hours and 72 hours),16 patients in each subgroup.Other 48 cases without cerebral infarction were selected as control group,including 16 cases of transient ischemic attack,16 cases of cerebral hemorrhage and 16 cases of healthy contrast group.The content of blood β-actin was detected by enzyme-linked immunosorbent method and analyzed combined with clinical condition.Results:①The content of blood β-actin in the cerebral infarction group was significantly higher than those in the control group (P＜0.05).②The diagnostic kit for ACI was determined at 2.10 ng/mL by ROC curve.It had high sensitivity and specificity.③The level of blood β-actin in patients with acute cerebral infarction has certain correlation with the area of cerebra1 infarction as well as NIHSS scores.Conclusion:The elevated level of blood β-actin may be a practical biomarker of acute cerebral infarction in ultra early stage.

Key words:acute cerebral infarction; ultra early stage; β-actin; biomarker

通信作者：何松彬，主任醫師，Email：1998hsb@163.com。

作者簡介：張亞萍（1987-），女，浙江臺州人，碩士生。

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（Y2111264）；浙江省醫藥衛生一般研究計劃項目（2012KYB224）；舟山市科技計劃項目（10141）。

收稿日期：2015-07-25

[中圖分類號]R743.33

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.004