siRNA介導的FOXA2基因沉默對乙肝病毒復制的影響

張巖明　戎秀格　李廣平

[摘 要] 目的：探討小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）介導的FOXA2基因沉默對乙肝病毒（HBV）復制的影響。方法：設計靶向FOXA2基因siRNA序列，構建質粒轉染HuH-7人肝癌細胞。用QT-PCR和 RT-PCR 檢測細胞FOXA2基因mRNA變化；用Western blot檢測細胞FOXA2蛋白變化；用Northern blot分析FOXA2基因沉默后HBV RNA表達。結果：構建FOXA2基因穩定沉默的F-S細胞株，FOXA2基因與蛋白沉降效率明顯。FOXA2基因沉默后，HBV病毒3.5kbRNA升高，FOXA2抑制HBV病毒的復制。結論：FOXA2基因通過降低3.5kbRNA的表達抑制乙肝病毒的復制。

[關鍵詞] siRNA；FOXA2；乙肝病毒

中圖分類號：R575.1 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）02-052-03

DOI：10.11876/mimt201602019

乙肝病毒（HBV）引起的傳染性疾病。HBV是雙鏈環形結構[1]，3.5kbRNA包含C（核抗原）/P（DNA多聚酶）/S（表面抗原）/X（X蛋白），是HBV進行復制的關鍵因子。FOXA[2-3]是核轉錄因子，由FOXA1、FOXA2、FOXA3構成。FOXA是肝轉錄因子之一，在肝器官的形成和發展及肝進行新陳代謝過程中發揮重要作用。FOXA也是HBV復制的關鍵調控點，因為HBV病毒所有的啟動子和增強子均包含FOXA結合位點。大量實驗表明HBV轉基因鼠中轉入FOXA2，HBV復制降低，進而推斷FOXA2可以抑制HBV的復制。因此我們設計靶向FOXA2的siRNA序列，構建質粒轉染人肝癌細胞HuH-7，觀察FOXA2基因沉默后對乙肝病毒復制的影響。

1 材料

質粒載體（上海吉凱基因公司）；jetPRIME Transfection Reagent （Polyplus ）；Trizol（Invitrogen）；核酸提取試劑盒（莊盟國際生物基因公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific company）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康為世紀生物公司）；Golden view（莊盟國際生物基因公司）；β-Actin單克隆抗體（Cell Signaling company ）；FOXA2抗體（Abcam company）；miRNA Northern blot reagent （TAKARA company）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher Scientific company ）。

2 方法

2.1 細胞培養

HuH-7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、5% CO2 條件下孵育箱內培養。EDTA胰酶消化HuH-7細胞，取對數生長期細胞實驗。

2.2 細胞轉染及篩選

將1.5×105 HuH-7細胞接種于6孔板中，37℃、5% CO2 孵育箱中過夜。待HuH-7細胞貼壁覆蓋率70%～80%時，換新培養液，將含FOXA2-siRNA的質粒與jetPRIME轉染試劑按1：2混合滴加到6孔板1、2、3孔細胞上。同時將不含靶序列空質粒與jetPRIME轉染試劑按照同樣比例滴加到6孔板4、5孔細胞上。第6孔為陰性對照只加培養液（陰性組）。轉染3周后挑取單克隆進行鑒定。將FOXA2基因沉默細胞株命名為F-S細胞株；空質粒細胞株命名為K-S細胞株。提取F-S細胞株、K-S細胞株、HuH-7細胞基因和蛋白，用QT-PCR、RT-PCR及Western blot對siRNA介導FOXA2基因沉默進行驗證。

2.3 QT-PCR、RT-PCR 法檢測FOXA2基因mRNA

表達

用Trizol試劑1mL分別裂解F-S細胞株、K-S細胞株、HuH-7細胞株；加入0.2mL氯仿，顛倒混勻待兩液相分層后離心，取上清液至新EP管中；加與上清液等體積異丙醇混勻，室溫放置20min，離心棄上清；加入無水乙醇離心棄上清液并風干；加入30μL RNAase-free ddH2O，反復吹打混勻，獲得細胞總RNA，經反轉體系得到cDNA。QT-PCR條件：底物液12μL，H2O7.5μL，引物（FOXA2、Actin）2μL，模板2μL。RT-PCR對FOXA2基因引物進行擴增，條件如下：98℃ 10s，60℃30s，72℃30s，32個循環。RT-PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀顯示，以ActinPCR擴增作為內參對照。

2.4 Western blot檢測FOXA2蛋白變化

用蛋白抽提試劑分別提取F-S細胞株、K-S細胞株、HuH-7細胞株總蛋白，測定蛋白濃度，用Western blot檢測FOXA2蛋白表達。具體步驟：配置分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE 80V電泳3h后轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶封閉，抗FOXA2抗體（1：500）4℃過夜，二抗（1：2000）37℃孵育1h，ECL試劑盒化學發光后曝光成像，同時檢測Actin（1：500）表達作為內參對照。

2.5 Northern blot 檢測 HBV RNA 表達

用 Trizol 法分別提取F-S細胞株、K-S細胞株、HuH-7細胞RNA。電泳：配置15%尿素變性PAGE膠，將樣品與RNA loading按比例混合，70℃5min，立即置于冰上，上樣恒壓80V電泳；轉膜：組裝轉膜結構濾紙、膠、膜、濾紙，恒壓60V轉膜1h；雜交：將膜放入雜交管中，加入雜交緩沖液42℃旋轉震蕩30min ，棄液加入雜交緩沖液+mRNA探針42℃旋轉震蕩30min，棄液加入雜交緩沖液+探針信號擴增素42℃旋轉震蕩2h；信號檢測：將膜放入顯色盒中，封閉30min，加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素40min，加入化學試劑曝光成像。

3 結果

3.1 F-S細胞株 FOXA2基因mRNA水平變化

3.1.1 QT-PCR法檢測F-S細胞株沉默效率 圖1a為FOXA2基因在F-S細胞株、K-S細胞株、HuH-7細胞中定量表達。對比HuH-7細胞與K-S細胞發現，空質粒基因對沉默效率影響不大，表明其在基因水平對沉默效率影響不顯著，而F-S細胞FOXA2基因沉默效率為89%，與K-S細胞相比有顯著性差異（P<0.05）。為了進一步驗證沉默細胞株穩定性，我們將F-S細胞接種到培養瓶中，每隔3d收集細胞，提取總RNA，用QT-PCR法檢測F-S細胞FOXA2基因表達。由圖1b得知，經過15次傳代，F-S細胞FOXA2基因沉默效率在80%～93%之間波動（P<0.05），顯示其沉默效果穩定。

3.1.2 RT-PCR法檢測F-S細胞株FOXA2基因表達 將F-S細胞株、K-S細胞株、HuH-7細胞株分別提取總RNA，反轉錄成cDNA后，應用RT-PCR法檢測FOXA2基因表達。與HuH-7細胞相比，F-S細胞中FOXA2基因表達明顯降低（見圖2）。

3.2 Western blot 檢測F-S細胞株FOXA2蛋白水平變化

3.3 Northern blot 檢測 HBV RNA 表達情況

4 討論

慢性乙型肝炎[4-5]是我國最常見傳染病之一。1992年中國乙型肝炎表面抗原（HBeAg）攜帶者為9.75%，因此中國屬于乙肝病毒高流行區。自從2002年乙肝疫苗納入計劃免疫以來，乙肝感染率已下降為7.18%，與1992年相比，乙肝感染者已減少3000萬。然而乙肝病毒攜帶者，尤其是在幼年[6]感染乙肝病毒患者，30%左右會發展成為慢性乙肝，甚至是肝硬化或者肝癌。因此研究乙型肝炎分子機制變得尤為重要。

siRNA[7]作為一種新基因阻斷技術，具有高效、特異、低毒性等優點，目前已用于自身免疫性疾病、病毒感染、乙型肝炎 、癌癥等多種疾病研究中。在體外合成雙鏈RNA（doubles stranded RNA，dsRNA）由質粒導入細胞，核酸酶Ⅲ-Dier將其處理為21～23個堿基小干擾RNA（small interferencing RNA，siRNA）。siRNA與解螺旋酶、核酸酶等結合形成RNA誘導沉默復合物（RNA inducing silencing complex，RISC），然后與靶基因互補mRNA結合，將mRNA降解。

本次實驗我們用siRNA技術在HuH-7細胞中誘導FOXA2[8-10]基因沉默。從實驗結果來看，FOXA2基因在mRNA水平和蛋白水平都有明顯下降。多次實驗重復驗證，結果均是FOXA2基因和蛋白明顯下降，從而證明siRNA能有效阻斷FOXA2基因表達。在利用QT-PCR對FOXA2基因沉默效率連續監測，發現FOXA2基因沉默效率在80%～93%范圍波動，沒有明顯沉默效率丟失，這說明我們建立F-S細胞株比較穩定。

大量資料研究證實，HBV所有啟動子和增強子均包含FOXA[11-13]結合位點。從實驗中我們也可以觀察到，3.5kbRNA 在HuH-7細胞中表達量低，在FOXA2基因沉默F-S細胞中表達量增加。3.5Kb[14] RNA 包含precore RNA 和pgRNA。Precore RNA 編碼HBeAg，pgRNA編碼聚合酶，同時也是HBV 病毒DNA模板，是HBV復制關鍵基因。FOXA2可以降低pgRNA表達，從而抑制HBV復制。大量資料表明，在非肝來源細胞中，FOXA2可以通過誘導核激素受體，從而抑制HBV病毒復制。也有報道指出FOXA2可直接阻斷pgRNA延伸。這些結果都證實FOXA2具有負性調節HBV病毒復制功能，與本實驗觀點相符。

本實驗發現FOXA2基因通過降低3.5kbRNA的表達抑制乙肝病毒的復制，深入研究FOXA家族，尤其是對FOXA2基因進一步探索，可以為乙型肝炎分子治療[15-16]奠定基礎。

參 考 文 獻

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