滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓EMP及血清抗ds?DNA抗體的影響

程喜平，賴梅生，范 萍，梁康禮，胡小倩，凡 慧，陳金中

（1廣州醫科大學附屬第一醫院，廣東廣州510120；2南方醫科大學中醫學院，廣東廣州510515；3復旦大學遺傳所，上海200433）

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滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓EMP及血清抗ds?DNA抗體的影響

程喜平1，賴梅生2，范 萍1，梁康禮1，胡小倩1，凡 慧1，陳金中3

（1廣州醫科大學附屬第一醫院，廣東廣州510120；2南方醫科大學中醫學院，廣東廣州510515；3復旦大學遺傳所，上海200433）

【摘 要】目的：觀察滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓EMP及血清抗ds?DNA抗體的影響.方法：以滋陰清熱方干預狼瘡鼠，免疫組化方法觀察EMP陽性細胞在骨髓的組織形態，定量PCR檢測EMP基因表達，同時檢測血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白.結果：狼瘡模型鼠骨髓EMP陽性細胞比正常對照組密集，基因表達增高，血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白也更高；滋陰清熱藥狼瘡模型鼠組與生理鹽水狼瘡模型鼠組EMP的基因表達組間比較明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白也明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）.結論：EMP可能是滋陰清熱藥治療SLE新的作用靶點.

【關鍵詞】滋陰清熱藥；幼紅細胞巨噬細胞連接蛋白；抗ds?DNA抗體；紅斑狼瘡

0 引言

國醫大師禤國維教授總結的滋陰清熱方對系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）有確切療效，探索滋陰清熱方作用機理具有積極意義.哺乳動物紅細胞脫核現象循環發生.目前已知骨髓造血島巨噬細胞和有核幼紅細胞之間的主要連接蛋白是幼紅細胞巨噬細胞連接蛋白（erythroblast macro?phage protein，EMP），而SLE病情重度活動時，骨髓組織可以發現噬血細胞，噬血細胞的本質是骨髓巨噬細胞吞噬有核紅細胞［1－2］.據此，我們推測EMP參與SLE發病并可能是中西醫藥物作用的靶點，為此本研究探討了滋陰清熱方對骨髓組織EMP的影響，同時觀察對血清抗DS?DNA抗體濃度，結果具有積極的意義.

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 16只雌性MRL／LPR狼瘡鼠模型鼠，12周齡，體質量25.1～30.4（平均27.6）g，隨機分為兩組：滋陰清熱方模型鼠組8只，模型鼠對照組8只.16只正常B6小鼠，隨機分為兩組：滋陰清熱方中藥正常鼠對照組8只，正常鼠對照組8只.動物均購自南京大學動物模型實驗中心.

1.2 試驗用藥 滋陰清熱方組：山萸肉15 g、生地黃20 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、牡丹皮15 g、青蒿8 g、甘草6 g（由廣州醫科大學附屬第一醫院中藥房提供），水煎后，濃縮處理（中藥含藥量為94 g），生藥濃度1.5 mg／mL，0.02 mL·g－1·d－1，灌胃1次／d；空白對照組：生理鹽水0.6 mL，灌胃1次／d，均干預治療6周.處死前代謝籠收集各組實驗鼠24 h尿液.用考馬斯亮藍法測定尿蛋白含量.

1.3 實驗方法和試劑 脫頸處死小鼠，心臟取血進行抗ds?DNA抗體檢測，骨髓進行定量PCR和免疫組化檢測.剝離四肢肌肉，前肢長骨固定石蠟做免疫組化檢測，后肢剪去兩端軟骨露出紅色的骨髓腔.冰上操作，吸取5 mL冷凍的PBS液沖洗骨髓腔，離心去上清，提取總RNA進行EMP基因表達檢測，引物購自上海Life Technology公司訂購，引物序列：上游5’?ACCCGACCCTCAAGGTGCCC?3’，下游5’?GTGGC?CG TCTCACGCCTCTC?3’.

1.3.1 RT?PCR 總RNA提取，用TRizol試劑按試劑盒進行；PCR實驗：Roche Light Cycle 480軟件，在“Template”下拉菜單中選擇“kappa”，反應條件，40個循環.

1.3.2 免疫組化 小鼠后肢骨標本采用EDTA脫鈣液，微波修復，二甲苯脫蠟，高壓抗原修復，常規免疫組化操作.

1.3.3 血清抗ds?DNA抗體檢測 按試劑盒說明進行相關操作在分光檢側儀上讀取450 nm波長的OD值.

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0軟件處理數據，采用t檢驗，以α＝0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓組織EMP的影響

2.1.1 小鼠骨髓組織EMP免疫組化染色 狼瘡模型小鼠和正常小鼠骨髓組織均可見EMP染色陽性細胞（圖1）.EMP染色陽性細胞為棕黃色細胞，細胞漿、和細胞膜細胞核均被染色，但以細胞漿、細胞膜染色明顯.在骨髓中，EMP染色陽性細胞均是大細胞，大細胞周圍均有數目不等的有核細胞圍繞，狼瘡模型鼠EMP染色陽性細胞比正常鼠密度高，滋陰清熱藥狼瘡模型鼠組EMP染色陽性細胞密度比狼瘡模型鼠對照組低.

圖1 小鼠骨髓組織EMP免疫組化染色

2.1.2 滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓組織EMP的mRNA表達的影響 生理鹽水組的狼瘡模型鼠組與正常鼠對照組EMP的mRNA表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）；滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和生理鹽水狼瘡模型鼠組EMP的mRNA表達組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）.

表1 各實驗組小鼠骨髓組織EMP的mRNA表達

2.2 滋陰清熱藥對狼瘡鼠血清抗ds?DNA抗體的影響 生理鹽水組的狼瘡模型鼠組與正常鼠對照組抗dsDNA抗體表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表2），滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和生理鹽水狼瘡模型鼠組抗dsDNA抗體表達組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）.同時生理鹽水組的狼瘡模型鼠組與正常鼠對照組尿蛋白表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表2），滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和生理鹽水狼瘡模型鼠組尿蛋白表達組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）.

表2 各實驗組小鼠血清抗dsDNA抗體情況

3 討論

哺乳動物骨髓紅細胞脫核成熟時，幼紅細胞脫落的核被巨噬細胞吞噬，在SLE狼瘡病情極度活動時，巨噬細胞活化并吞噬幼紅細胞，出現噬血細胞［1－2］，二者可能存在一定聯系.EMP是巨噬細胞和有核幼紅細胞連接蛋白，EMP的缺乏會造成紅細胞脫核成熟的失敗［3－6］，影響巨噬細胞分化發育及極化［7］，我們推測EMP參與SLE疾病發生發展并發揮重要作用.國醫大師禤國維教授根據臨床經驗總結了滋陰清熱方，對SLE有確切療效，闡明其機理一直是人們的努力方向.為此本研究探討了滋陰清熱方對骨髓EMP的作用變化，并以血清抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白作參考，分析滋陰清熱方對骨髓EMP的作用及意義.

本研究結果顯示，狼瘡鼠和正常鼠骨髓EMP均可見陽性細胞，正常鼠骨髓組織中的細胞密度低，無細胞的空白背景清晰散在均勻，病理切片上的EMP陽性細胞體積形態是周圍有核細胞10倍左右，棕黃色染色在細胞膜處明顯加深，EMP陽性細胞周圍圍繞有核細胞.EMP由骨髓的巨噬細胞生成，逐漸從細胞漿向細胞膜過渡，最后聚集細胞膜發揮連接巨噬細胞和幼紅細胞的作用，形成骨髓造血島，EMP陽性細胞周圍圍繞有核細胞結構符合骨髓造血島形態.

EMP的定量PCR檢測結果顯示，未用藥的狼瘡模型鼠組比正常鼠對照組EMP的mRNA表達顯著性升高，說明EMP參與SLE發病；而滋陰清熱藥組狼瘡模型鼠和未用藥狼瘡模型鼠組EMP的mRNA表達組間比較明顯下降，說明滋陰清熱藥可能通過調控EMP發揮治療SLE的作用.

我們研究滋陰清熱藥對狼瘡鼠骨髓組織EMP的影響時，選用血清抗dsDNA抗體濃度和尿蛋白作為參照，結果顯示，血清中抗ds?DNA抗體濃度和尿蛋白變化規律與骨髓組織中的EMP變化規律類似，相關結果結合分析提示，EMP可能參與狼瘡發病機理并與狼瘡病情活動及器官損害有關.

值得指出的是，巨噬細胞不僅是紅細胞脫核成熟的關鍵功能細胞，同時也是機體的重要免疫功能細胞.我們尤其關注的是EMP由巨噬細胞產生，是紅細胞脫核成熟重要功能蛋白，協助巨噬細胞吞噬紅細胞脫落的細胞核［8］，而包括SLE在內的結締組織病核心機理之一是機體產生抗核抗體，本研究提示EMP的變化規律與抗ds?DNA抗體變化規律及尿蛋白密切相關.我們推測EMP可能是巨噬細胞參與SLE核心發病機理并調控抗核抗體產生的功能蛋白之一，也可能是滋陰清熱藥等防治SLE藥物作用靶點，值得我們深入研究.

【參考文獻】

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·基礎與轉化醫學·

METHODS：Lupus mice were treated with Nourishing Yin Clear?ing Heat herbs.The histomorphology of EMP positive cells in bone marrow were observed by immunohistochemistry，EMP gene expression were detected by quantitative PCR，and the concentra?tion of serum anti ds?DNA antibody and Proteinuria was detected respectively.RESULTS：Compared with normal control group，the lupus mice had more intensive of EMP positive cells and high?er EMP gene expression in bone marrow，also had higher concen?tration of serum anti ds?DNA antibody and Proteinuria.Compared with lupus mice control group，the intensive of EMP positive cells and EMP gene expression of the Nourishing Yin Clearing Heat Herbs lupus mice group was decreased，and concentration of ser?um anti ds?DNA antibody and Proteinuria was also decreased.

CONCLUSION：EMP may be a new target of treatment for sys?temic lupus erythematosus（SLE）by Nourishing Yin and Clearing Heat Herbs.

Effects of Nourishing Yin and Clearing Heat Herbs on bone marrow EMP and anti ds?DNA antibody in tissue of lupus mice

CHENG Xi?Ping1，LAI Mei?Sheng2，FAN Ping1，LIANG Kang?Li1，HU Xiao?Qian1，FAN Hui1，CHEN Jin?Zhong31The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong 510120，China；2Department of Traditional Chinese Medicine of Southern Medical University，Guangdong 510515，China；3State Key Laboratory of Genetic Engineering，Institute of Genetics，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200433，China

【Abstract】AIM：To observe the effect on erythroblast macro?phage protein（EMP）and anti ds?DNA antibody in bone marrow tissue of lupus mice with Nourishing Yin Clearing Heat Herbs.

【Keywords】Nourishing Yin Clearing Heat Herbs；erythroblast macrophage protein；anti ds?DNA antibody；lupus erythematosus

通訊作者：范 萍.E?mail：fanping18＠163.com

作者簡介：程喜平.E?mail：cxpgz＠126.com

收稿日期：2015－11－12；接受日期：2015－11－29

文章編號：2095?6894（2016）02?08?03

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A