D1/D2、MLST及MALDI-TOF MS在新生隱球菌分類中的應用*＊?

劉濤華，王顏顏，呂　倩，牟麗麗，陳　燕，康穎倩＊

(貴州醫科大學微生物學教研室，貴州貴陽　550004)

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D1/D2、MLST及MALDI-TOF MS在新生隱球菌分類中的應用*＊?

劉濤華＊＊，王顏顏，呂倩，牟麗麗，陳燕，康穎倩＊＊＊

(貴州醫科大學微生物學教研室，貴州貴陽550004)

［摘要］目的:比較單一D1/D2區域測定、多位點測序分型技術(MLST)和基質輔助激光解吸－飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)在新生隱球菌(Cryptococcus podzolicus)及與之鄰近的其他種屬的分類研究的穩定性和可靠性。方法:挑選以Cryptococcus podzolicus為主及與之相鄰的其他種和屬的菌株共20株及1株outgroup模式菌株，運用酵母菌基因組提取試劑盒提取其DNA，PCR擴增5個管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1)并測序，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)、最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別構建5個管家基因及D1/D2基因序列的系統發育樹;應用MALDI-TOF-MS采集蛋白指紋圖譜，在BrukerDaltonics數據庫(BDAL)和CBS真菌保藏中心數據庫信息的基礎上，對20株菌進行聚類分型，構建聚類分型樹狀圖。結果: 3種方法所得樹狀圖在種間的層面上，均出現了a、b、c 3個分支;在種內的層面上，特別是a這一分支，均為Cryptococcus podzolicus，單一D1/D2區域所構建的系統發育樹分化程度不大，各菌株間無明顯的分類多樣性，而MLST及MALDI-TOF MS所得到的樹狀圖在種內均出現了明顯的分類多樣性及親緣關系的差異性。結論: MLST及MALDI-TOF MS均可作為隱球菌屬中菌株分類鑒別中有效的分子生物學方法，能可靠地揭示隱球菌屬中各菌種的種間及種內的遺傳進化關系，MALDI-TOF-MS比MLST則更為快捷準確。

［關鍵詞］多位點測序分型;基質輔助激光解吸飛行時間質譜;新隱球菌;分類法;發育生物學;進化

［筑科合同(2011103) 16號］;貴州省國際科技合作計劃項目［黔科合外G字(2014) 7006］

＊＊貴州醫科大學2013級碩士研究生

＊＊＊通信作者E-mail: joycekangtokyo@ qq.com

網絡出版時間: 2016－02－23網絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2055.054.html

隱球菌屬(Cryptococcus)屬于擔子菌門銀耳綱銀耳目銀耳科，隱球菌屬下約有37個種，通常棲息在土壤中，屬中的新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)可使愛滋病患者罹患嚴重的腦膜炎或腦膜腦炎。對于Cryptococcus的分類研究，傳統的方法主要是根據菌體的外部形態特征和生理生化特征，敏感性和特異性差，準確度不高。本課題前期研究發現，Cryptococcus podzolicus在進化樹附近出現了一些其他屬的菌，如Bullera和Trimorphomyc。Bandoni和Boekhout等［1－2］發現Trimorphomyc與Cryptococcus podzolicus除了生殖結構不同外，形態上也不一樣，而Bullera沒有這些差異，很難通過傳統形態學的分類方法對其進行分類。Keisha Findley等［3］通過MLST技術對致病性格特隱球菌(Cryptococcus gattii)［4］和Cryptococcus neoformans之間的關系以及其在系統發育樹中的具體位置展開了研究。基質輔助激光解吸－飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近幾年發展起來的一種新型軟電離生物質譜，它能完成菌體多種成分的分析，包括蛋白質、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被離子化的分子。MALDI-TOF-MS具有快速、準確、靈敏、分辨率高、高質量檢測范圍等優點，成為臨床診斷、食品生產、環境監測以及軍事領域研究的一種有力手段［5－6］。本研究通過單一D1/D2區域測定、多位點測序分型技術(MLST)和基質輔助激光解吸－飛行時間質譜技術(MALDITOF-MS)在Cryptococcus podzolicus及與之鄰近的其他種屬分類的比較研究，旨在探討適合Cryptococcus分類的分子分類方法。

1　材料與方法

1.1實驗菌株與試劑

挑選以Cryptococcus podzolicus為主及與之相鄰的其他種和屬的菌株共20株，包括Cryptococcus podzolicus、Cryptococcus flavus、Cryptococcus paraflavus、Bullera miyagiana、Bullera sakaeratica及Trimorphomyces papilionaceus，由荷蘭真菌多樣性研究中心、日本千葉大學真菌研究所惠贈。在進化樹上所加的outgroup選擇了Cryptococcus neoformans，CBS 132這一模式菌株，其數據來自于GenBank(見表1)。PDA和YPD培養基均購自日本Wako Pure Chemical Industries Ltd公司，基因組提取試劑盒購自天根生化科技公司，PCR相關試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

表1　21株實驗菌株種名Tab.1　List of 21 strains in the experiment

1.2多位點測序分型

1.2.1菌株培養及DNA的提取所有菌株均用YPD液體培養基復蘇，接種在PDA培養基上，溫度為25℃，培養24 h，挑取菌落;參照酵母菌基因組提取試劑盒操作說明書提取基因組DNA模板。

1.2.2 PCR擴增及凝膠電泳分析擴增的5個基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2及tef1)，PCR反應引物見表2，PCR擴增條件見表3。將擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，100 V穩壓20 min，在紫外透射儀下觀察。PCR產物送往上海生工生物工程有限公司進行測序。

表2　MLST測序位點及對應引物Tab.2 Primers of MLST loci

表3　PCR擴增反應條件Tab.3 PCR amplification reaction conditions

1.2.3 DNA序列系統發育分析對所獲得的序列，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)、最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別構建ITS和5個管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1)的系統發育樹進行比較分析。

1.3 MALDI-TOF-MS檢測

1.3.1樣品處理取菌株新鮮培養物，在Eppendorf管中加入純凈水300 μL，挑取適量(5～10 mg)菌落混勻，再加入無水乙醇900 μL，混勻后以12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入70%甲酸50 μL混勻，再加入乙腈50 μL混勻，以12 000 r/min離心2 min，吸取上清液，涂布于96孔樣品板上，自然晾干1 h后，用基質溶液α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)覆蓋菌苔，每孔1 μL。晾干后進行質譜分析。

1.3.2數據采集將上樣的樣品板小心置于板孔中，有樣品面朝上，蓋上蓋子，抽真空。打開儀器控制軟件FlexControl 3.3.108.0，調好校準儀器參數，采集樣品的質譜圖，保存數據，通過MALDI-TOF MS Biotyper RTC 3.0軟件進行分析。

1.3.3 MALDI-TOF-MS結果判斷所采集的質譜圖與BrukerDaltonics數據庫(BDAL)和CBS真菌保藏中心數據庫中標準圖進行比對，鑒定分值≥2.0表示可鑒定到種水平，2.300～3.000表示菌種鑒定的可信度較高，1.700～1.999表示可鑒定到屬，0.000～1.699表示不可信的鑒定。

1.3.4聚類分析對21株菌的蛋白質質量圖譜進行聚類分析，采用相似分值構建系統樹。

2　結果

2.1分子分類

2.1.1單一D1/D2區域系統發育將所獲得的序列，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)構建單一的D1/D2基因的系統發育樹(見圖1)，以最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別進行比較，圖中所示數值分別表示Bayesian方法的后驗概率值，鄰接法的引導百分率和最大似然法的引導百分率。從圖1的系統發育進化樹可見，在種間的層面上，主要出現了a、b、c 3個分支，而在種內的層面上，特別是a這一分支，均為Cryptococcus podzolicus，其分化程度不大，各菌株無明顯的分類多樣性，其親緣關系無明顯差異。

2.1.2多位點序列系統發育將所獲得的序列，以Bayesian法(MrBayes3.2.1)構建4個管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2)的系統發育樹(見圖2)，以最大似然法、鄰接法(MEGA 6.0軟件)分別進行比較，圖中所示數值分別表示Bayesian方法的后驗概率值，鄰接法的引導百分率和最大似然法的引導百分率。從圖2的系統發育樹可見通過MLST所構建的系統發育進化樹在種間的層面上，均出現a、b、c 3個分支，而種內的層面上，其區分程度更高，特別是a這一分支，均為Cryptococcus podzolicus，各菌株之間的親緣關系較大，出現了種內的分類多樣性。

圖1　基于D1/D2區域構建的系統發育樹Fig.1 The phylogenetic relationships among species of Cryptococcus inferred from sequences of D1/D2

圖2　基于多位點序列(ITS，LSU，rpb1，rpb2)構建的系統發育樹Fig.2　The phylogenetic relationships among species of Cryptococcus inferred from a five-gene data set including sequences of ITS，LSU，rpb1，rpb2

2.2 MALDI-TOF-MS

對所有菌株的蛋白質質量圖譜進行聚類分析，采用相似分值構建系統樹，得到MSP聚類分析樹狀樹。在種間的比較層面，出現a、b、c 3個分支，a這一分支里面都是Cryptococcus podzolicus，從圖3中可清晰的看到Cryptococcus podzolicus中各菌株之間的進化關系，出現了明顯的分類多樣性，各菌株之間的親緣關系差異較大。

圖3　MSP聚類分析樹狀樹Fig.3 Clustering classification tree of 21 srains of Cryptococcus by MALDI-TOF-MS

3　討論

在絕大多數的真核生物中，表現出了極為廣泛的序列多態性，即使親緣關系非常近，也能顯示不同的進化特征，但有的真菌由于進化順序、變異等原因，在間隔區及核糖體大亞基序列上差異性較小［13］。前期的隱球菌的分類鑒定研究發現，ITS及D1/D2序列雖然在物種屬內、近緣屬間乃至科內系統進化關系研究中有一定的價值，但不適合屬內種及種群的分類。本研究主要選取了Cryptococcus podzolicus和與之鄰近的一些其他種和屬的菌株，比較分析單一D1/D2區域、MALDI-TOF-MS及MLST 3種技術的穩定性和準確性。

在MLST研究方面，本文中所使用的菌株大部分都可得到其目的片段，但還是存在4株菌株的tef1基因片段測序失敗，可能是該基因序列本身存在問題，比較難進行PCR擴增或者是測序反應，Schoch等［14］在研究過程中也發現了這一問題，因此本研究構建4個管家基因(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2)的系統發育樹和單一D1/D2區域的系統發育樹進行對比研究。從圖1和圖2的系統發育樹可見均出現a、b、c 3個分支，各菌株的大體位置相似，但兩者又存在這一些差異。相似的地方是Cryptococcus podzolicus都在同a分支上，b這一分支也相同，不同之處在于MLST所構建的系統發育樹各菌株間的區分程度更高，從樹中更加清晰的了解Cryptococcus podzolicus種內菌株之間的進化關系，另外一個差異則是Bullera miyagiana的位置，從MLST所得的系統發育樹來看，其應該更靠近b這一分支，由此可見間隔區及核糖體大亞基在序列上差異性較小，不適合屬內種及種群的分類，而MLST在隱球菌的種間及種內分類研究則更加穩定和可靠。

在MALDI-TOF-MS研究方面，根據所得到的MSP聚類分析樹狀圖與單一D1/D2區域構建的系統發育樹比較分析，二者均出現了a、b、c 3個分支，相似的地方是Cryptococcus podzolicus都在同一分支上，b這一分支也相同，不同之處在于MALDITOF-MS所得到的MSP聚類分析樹各菌株間的區分程度更高，從樹中更加清晰的了解Cryptococcus podzolicus種內菌株之間的進化關系，還有則是Bullera miyagiawa的位置，其應該更靠近b這一分支。由此可見MALDI-TOF-MS相比與傳統的D1/D2區域分析，在隱球菌的種間及種內分類研究則更加穩定和可靠。

MALDI-TOF-MS結合MLST和D1/D2區域分析可見，圖3中的Ⅰ和Ⅱ簇菌有2株Cryptococcus podzolicus菌成為獨立的1個分支，而在圖2中，均出現了同樣的分支，綜合目前荷蘭真菌多樣性研究中心已測得的生理生化數據，發現第Ⅰ簇的菌株在C23Glycerol和C28D-Glucitol的碳源利用實驗中，其結果與其他Cryptococcus podzolicus菌株的結果存在差別，而第Ⅱ簇的菌株在C21Inulin、C28Ribitol和C38DL-Lactate的碳源利用試驗及N1Nitrate、N6Creatine和N9Imidazole的氮源利用試驗與其他Cryptococcus podzolicus菌株的結果有所不同，這充分說明MALDI-TOF技術及MLST技術在種內具有較強的區分能力。第Ⅲ簇的菌株包括了Cryptococcus paraflavus和Cryptococcus flavus兩個種的分支，在生理生化實驗中也可發現在C9L-Rhamnose、C11Maltose、C13Me a-D-Glucoside、C15Salicin、C25Ribitol、C29D-Mannitol、C30Galactitol和C31myo-Inositol的碳源利用試驗及N2Nitrite、N3Ethylamine和N5Cadaverine的氮源利用試驗結果存在著明顯的差異，這說明MALDI-TOF-MS技術及MLST技術在種間也具有較強的區分能力。

綜上，MLST及MALDI-TOF MS均可作為隱球菌屬分類鑒別中有效的輔助鑒別的分子生物學方法，相比于傳統的生理生化試驗及間隔區和核糖體大亞基序列比較，二者均可準確地揭示隱球菌種間及種內各菌種的遺傳進化關系，相比于MLST技術較長的實驗周期及某些基因擴增和測序結果的不確定性，MALDI-TOF-MS技術則更為快捷，成功率更高。

4　參考文獻

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(2015－08－10收稿，2015－11－23修回)

中文編輯:劉平;英文編輯:劉華

·基礎研究·

Application Research of Phylogenetic Analysis of Cryptococcus podzolicus with D1/D2，MLST and MALDI-TOF MS

LIU Taohua，WANG Yanyan，LU Qian，MOU Lili，CHEN Yan，KANG Yingqian
(Department of Microbiology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To compare and analyze the stability and reliability of multilocus sequence typing (MLST) and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) methods in taxonomic study of Cryptococcus，especially for Cryptococcus podzolicus.Methods: Twenty strains including Cryptococcus podzolicus and its adjacent strains were selected for the evaluation in this study; DNA was extracted using yeast genome extraction kit and 5 genes(ITS，D1/D2，rpb1，rpb2，tef1) were amplified and sequenced.The phylogeny tree was constructed by Bayesian，maximum parsimony and neighbor-joining analyses.The protein fingerprint acquisition parameters were collected by MALDI-TOF-MS method.Clustering classification was conducted for the twenty strains and the phylogenetic tree was constructed based on BDAL and CBS fungi preservation center database.Results: There existed three clusters(a，b and c) in inter species level that can be observed on the phylogenetic trees made by three different molecular methods; In intraspecific level，all Crypto-book=140,ebook=21coccus podzolicus strains were classified into Cluster a，in which there was no apparent taxonomic diversity for the strains in the phylogenetic tree constructed by D1/D2，while the evolution distances among Cryptococcus podzolicus strains were easily identified by both MLST and MALDI-TOF-MS methods.Conclusion: MALDI-TOF-MS methods can be more effective for identification and classification of Cryptococcus species.Moreover，MALDI-TOF-MS is more efficient and accurate than MLST.

［Key words］multilocus sequence typing; matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; Cryptococcus podzolicus; classification; developmental biology; evolution

*［基金項目］國家自然科學基金(31060006，31260029) ;貴州省社會發展科技攻關項目［黔科合SY字(2011) 3017號］;貴陽市科技局社會發展與民生計劃

［中圖分類號］R379.5

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0139-06