基于Nrf2信號通路的三七總皂苷對Aβ25－35誘導PC12細胞凋亡的保護作用機制研究

趙靜宇，汪夢霞，趙自明，孟祥寶，孫桂波，孫曉波

［1.廣州中醫藥大學附屬廣東省第二中醫院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州 510095，3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，中藥（天然產物）創新藥物研發北京市重點實驗室，北京 100193］

基于Nrf2信號通路的三七總皂苷對Aβ25－35誘導PC12細胞凋亡的保護作用機制研究

趙靜宇1，2，汪夢霞1，2，趙自明2，孟祥寶3，孫桂波3，孫曉波3

［1.廣州中醫藥大學附屬廣東省第二中醫院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東廣州 510095，3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，中藥（天然產物）創新藥物研發北京市重點實驗室，北京 100193］

目的 探討三七總皂苷對Aβ25－35誘導的PC12細胞凋亡的保護作用及分子機制。方法 利用Aβ25－35誘導PC12細胞損傷模型，MTT法檢測PC12細胞活力，試劑盒測定LDH漏出量、ROS水平、MDA含量、Caspase-3活力以及抗氧化酶SOD、CAT和GHS-Px活力，TUNEL染色檢測細胞凋亡，JC-1染色觀察線粒體膜電位，Western blot檢測相關蛋白HO-1、Lamin-B、細胞核內Nrf2及總Nrf2的蛋白表達。結果三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導的PC12細胞活力下降（P＜0.01）和LDH漏出（P＜0.01），減少ROS和MDA的產生（P＜0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P＜0.01），穩定線粒體膜電位，抑制caspase-3的活化（P＜0.01）。而且，三七總皂苷還能夠上調PC12細胞細胞核Nrf2、總Nrf2和細胞質中HO-1的蛋白表達。HO-1抑制劑SnPP能夠抑制三七總皂苷的神經保護作用。結論 三七總皂苷可能通過上調Nrf2/HO-1信號通路，從而抑制Aβ25－35誘導PC12細胞氧化應激和凋亡。

阿爾茨海默病；三七總皂苷；氧化應激；凋亡；Nrf2；HO-1

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種最常見的老年癡呆癥。目前全球大約有3 500萬患者，已成為繼心血管疾病和腫瘤之后，嚴重影響人類健康的第3位因素［1－2］。隨著人口老齡化的加劇，AD的發病率也逐年上升，給患者本身及其家庭和社會造成了沉重的經濟負擔。因此，開發具有防治AD作用的藥物迫在眉睫。

AD的主要病理特征是β淀粉樣蛋白細胞外沉積形成的老年斑、細胞內過度磷酸化的Tau蛋白為核心形成的神經原纖維纏結以及神經元的丟失［3］。盡管國內外學者對AD的研究有了很大進步，但AD的具體發病機制目前還不清楚。近年來的研究發現，氧化應激和凋亡促進了AD的發生發展［4］。因此，深入研究藥物抗AD的作用靶點和分子機制，對AD的防治具有重要意義。

細胞自身為應對氧化應激啟動了很多保護性機制，包括抗氧化劑和內源性抗氧化酶系統。其中抗氧化酶包括HO-1、SOD、CAT和GSH-Px等。藥物誘導這些抗氧化酶表達能夠增強神經細胞對氧化應激的抵抗能力。這些抗氧化酶的轉錄表達主要受Nrf2/ARE信號通路的調控。在靜息狀態下，Nrf2在胞質中與Keap1結合形成復合體。當復合體遭到破壞，Nrf2會轉位至細胞核內與ARE序列結合，促進抗氧化酶的表達［5］。

目前臨床上針對AD的藥物很少，而且這些藥物都是對癥治療，并不能逆轉或根治AD，因此尋找有效的AD防治藥物顯得非常迫切。天然藥物尤其是中藥，一直以來在疾病防治方面都有著明顯的優勢。從中藥中發掘和開發具有神經細胞保護作用的化合物和防治AD的藥物，已經成為國內外新藥研發的熱點。

三七是我國傳統名貴中藥，為五加科人參屬植物三七的干燥根，其性甘、溫，微苦，主入肝、胃經，具有化瘀止血，活血定痛的功能，臨床上主要用于心腦血管疾病的治療。三七總皂苷是三七的主要活性成分，文獻報道三七中的一些單體成分如人參皂苷Rg1、Rb1等對AD具有防治作用［6］。但是，三七總皂苷防治AD的藥效及其作用機制，目前尚不清楚。

因此，本研究通過建立AD體外模型Aβ25－35誘導PC12細胞凋亡，從氧化應激和凋亡角度考察三七總皂苷的神經保護作用，并考察三七總皂苷對Nrf2/HO-1信號通路的調控作用，探索三七總皂苷防治AD的分子機制。為進一步研究中藥抗AD的分子機制提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑 三七總皂苷購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；PC12細胞由中國醫學科學院北京協和醫學院細胞庫提供；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；LDH、MDA、SOD、CAT和GSH-Px檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ROS檢測試劑盒和JC-1購自美國Enzolife sciences；Caspase-3熒光檢測試劑盒購自美國BioVision；Nrf2 和HO-1抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；In Situ Cell Death Detection Kit，POD試劑盒購自美國Roche。

1.2 主要儀器 二氧化碳培養箱購自美國Thermo Scientific；超凈工作臺購自上海智成分析儀器制造有限公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus；離心機購自中國Anke；酶標儀購自美國Bio-Tek；熒光顯微鏡購自德國Leica；PYY-7C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；Chemi DOCTM型凝膠成像系統購自美國Bio-Rad。

2 方法

2.1 細胞培養和藥物配制 PC12細胞用含有10％胎牛血清，5％馬血清，100 000 U·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM完全培養基進行培養。三七總皂苷溶于DMSO配制成儲備溶液（100 g ·L－1），然后稀釋成所需濃度使用。空白對照組細胞DMEM中添加等量的DMSO，濃度不高于1‰。

2.2 MTT法檢測細胞活力 PC12細胞經實驗處理后，吸掉培養液，加入MTT溶液（終濃度為1 g· L－1），37°C繼續孵育4 h。然后用DMSO溶解細胞產生的甲。將96孔板置振蕩器中振搖10 min后，置酶標儀中，570 nm處測定每孔OD值。細胞活力用實驗組OD值占正常對照組OD值的百分比表示。

2.3 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率檢測 收集細胞培養液，測定培養液中LDH活力，胰蛋白酶消化收集細胞，反復凍融破碎細胞，測定細胞中LDH活力，LDH漏出率＝培養液中LDH活力/（培養液中LDH活力＋細胞中LDH活力）。

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 PC12細胞（每孔1 ×105）種植于放在6孔板中的細胞爬片上，繼續培養24 h。細胞經實驗處理后，4％多聚甲醛室溫固定30 min。PC12細胞滴加0.3％H2O2孵育30 min，并滴加0.1％Triton X-100溶液孵育30 min。滴加N末端脫氧核苷酸轉移酶后，細胞爬片置于濕盒中37℃孵育1 h，然后滴加抗地高辛結合物孵育30 min。DAPI（100 g·L－1）染細胞核，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.5 線粒體膜電位檢測 線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。線粒體膜電位的變化用JC-1染料檢測，常用紅綠熒光相對比例來衡量。PC12細胞經實驗處理后，加入JC-1溶液（終濃度為2μmol·L－1），37°C避光孵育30 min，PBS洗兩遍，DAPI（100 g·L－1）染細胞核，熒光顯微鏡進行觀察拍照。

2.6 Caspase-3活力檢測 Caspase-3是細胞凋亡過程中關鍵的執行分子。Caspase-3能分解底物DEVD-AFC釋放AFC，DEVD-AFC發藍光，游離的AFC發出黃綠熒光，用酶標儀測定AFC的熒光值就可以檢測Caspase-3活力。PC12細胞經實驗處理后，胰蛋白酶消化收集細胞，用50 μL的冷細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育10 min，經蛋白濃度測定后使用50 μg的細胞裂解物。每個樣品加入50 μL的2×反應緩沖液（含10 mmol·L－1DTT），加入5 μL 的DEVD-7-amino-4-trifluorom-ethylcoumarin（終濃度為50 μmol·L－1），37℃孵育2 h。酶標儀讀取樣品熒光值，激發波長為400 nm，發射波長為505 nm。

2.7 細胞內總ROS檢測 細胞內總ROS水平用總ROS檢測試劑盒測定。PC12細胞經實驗處理后，胰蛋白酶消化收集細胞，1×washing buffer洗1遍，加入carboxy-H2DCFDA（終濃度25μmol·L－1）溶液，37℃避光孵育30 min，用高內涵儀器檢測熒光值。

2.8 氧化應激水平檢測 收集PC12細胞培養上清液，使用南京建成試劑盒檢測PC12細胞MDA含量。胰蛋白酶消化收集PC12細胞，反復凍融裂解細胞。4℃，3 000 r·min－1離心10 min取上清，使用南京建成試劑盒測定抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力。

2.9 Western blot檢測蛋白表達 胰蛋白酶消化收集PC12細胞，加入含有蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和PMSF的組織蛋白抽提試劑，冰上裂解30 min。放入預冷的離心機離心，12 000 r·min－1離心15 min。吸取上清液至預冷的EP管中，－80℃保存待用。BCA試劑盒定量樣品蛋白濃度。將SDS-PAGE上樣緩沖液與蛋白樣品按1∶4混勻，煮沸5 min，使蛋白充分變性，－80℃保存待用。取等量蛋白樣品經10％SDS-PAGE，80V電泳至溴酚藍到達分離膠底部。將膠安裝至轉膜裝置，100 V，300 mA轉膜1 h。取NC膜置于5％脫脂牛奶（TBST配制）搖床封閉2 h。一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次15 min，HRP標記的二抗孵育2 h。TBST洗膜3次，每次15 min，用增強型ECL顯色液避光孵育5 min后，凝膠成像系統進行顯影拍照。

3 結果

3.1 三七總皂苷能夠抑制Aβ25－35誘導PC12細胞的細胞活力下降 Aβ25－35處理能夠以濃度和時間依賴的方式降低PC12細胞的細胞活力（Fig 1A，P ＜0.01），最終選擇20 μmol·L－1，作用24 h作為造模條件。不同濃度的三七總皂苷（6.25、12.5、25和50 mg·L－1）預孵育4、8、12和24 h能夠以濃度和時間依賴的方式抑制Aβ25－35誘導PC12細胞的細胞活力下降（Fig 1B，P＜0.01），最終確定三七總皂苷給藥濃度為25 mg·L－1，作用時間為24 h。而且，三七總皂苷預孵育能夠抑制Aβ25－35誘導PC12細胞LDH漏出（Fig 1C，P＜0.01）。然而，三七總皂苷只加藥對PC12細胞活力沒有影響（Fig 1D，P＞0.05）。表明三七總皂苷預孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞的細胞活力下降。

Fig 1 Effect of PNS on cell viability of PC12cells

3.2 三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞的凋亡 與對照組比較，Aβ25－35處理明顯增加TUNEL陽性細胞的數目（Fig 2A）和TUNEL陽性細胞率（Fig 2B，P＜0.01）。表明Aβ25－35處理能夠導致PC12細胞DNA斷裂。三七總皂苷預孵育能夠明顯抑制Aβ25－35導致的DNA斷裂（Fig 2）。我們進一步考察了線粒體膜電位的變化，Aβ25－35能夠明顯降低線粒體膜電位（Fig 2C、D，P＜0.01）。與對照組相比，Aβ25－35組的熒光值降低至80％，而PNS＋Aβ25－35組的熒光值則為95％。表明Aβ25－35能夠使PC12細胞線粒體膜電位去極化。同時，我們發現Aβ25－35能夠增強caspase-3活性（Fig 2E，P＜0.01）。與對照組相比，Aβ25－35組的熒光值增加至156.29％，而PNS＋Aβ25－35組的熒光值則為122.88％，三七總皂苷預孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導的線粒體膜電位的下降和caspase-3活性的增強（Fig 2C～E，P＜0.01），表明三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞的凋亡。

3.3 三七總皂苷預孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞氧化應激 與對照組比較，Aβ25－35處理導致PC12細胞內ROS濃度明顯增加（Fig 3A、B，P ＜0.01）。與對照組ROS熒光值相比，Aβ25－35組的熒光值增加至165.23％，PNS＋Aβ25－35組則為119.15％，脂質過氧化產物MDA也明顯增加（Fig 3C，P＜0.01）。而且，細胞內抗氧化酶SOD、CAT和 GSH-Px活力明顯下降（Fig 4D-4F，P＜0.01）。然而，三七總皂苷預孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導的這些氧化應激指標的變化。提示三七總皂苷預孵育能夠明顯抑制Aβ25－35誘導C12細胞氧化應激。

Fig 2 Effect of PNS on Aβ25－35induced apoptosis in PC12 cells

3.4 三七總皂苷預孵育能夠上調PC12細胞Nrf2 和HO-1的表達 為探討三七總皂苷的神經細胞保護作用機制，我們重點考察了三七總皂苷對PC12細胞Nrf2/HO-1信號通路的影響。Western blot實驗結果表明，三七總皂苷預孵育能夠明顯增加PC12細胞核內Nrf2的蛋白表達水平（Fig 4A）。同時，三七總皂苷預孵育能夠明顯增加PC12細胞質中HO-1的蛋白表達水平（Fig 4A）。我們進一步采用HO-1活性抑制劑SnPP預孵育PC12細胞，觀察SnPP對三七總皂苷介導的抗凋亡作用的影響，發現SnPP能夠抑制三七總皂苷介導的抗Aβ25－35毒性作用（Fig 4B）。與對照組相比，PNS＋Control組的蛋白濃度為升高到198.24％，PNS＋Aβ25－35組的蛋白濃度升高至188.13％，而PNS＋Aβ25－35＋SnPP組的則為135.50％。提示HO-1在三七總皂苷介導的抗Aβ25－35毒性作用中發揮重要作用。

Fig 3 Effect of PNS on Aβ25－35induced oxidative stress in PC12 cells

4 討論

盡管AD的發病機制目前尚未完全清楚，但是Aβ被廣泛認為是AD神經退行性病變的主要原因。如果使用藥物抑制Aβ的神經毒性，可能具有神經保護作用。此次實驗我們采用了一種普遍接受的體外模型，使用Aβ25－35誘導PC12細胞凋亡來考察三七總皂苷防治AD的神經保護作用。我們發現三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞活力的下降和LDH漏出，抑制Aβ25－35誘導PC12細胞DNA斷裂，并明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞線粒體膜電位的下降和caspase-3活化，表明三七總皂苷能夠明顯抑制Aβ25－35誘導PC12細胞凋亡。

Fig 4 Effect of PNS on expression of Nrf2 and HO-1 in PC12 cells

研究表明，氧化應激介導了Aβ的神經毒性并參與了AD神經細胞退行性過程。氧化應激是指活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生與機體內抗氧化防御系統的清除之間失衡，其中大量ROS的產生超過了內源性抗氧化酶系統的抗氧化能力。氧化應激能夠導致脂質過氧化，蛋白和DNA氧化和氧化還原狀態的改變，促進神經細胞凋亡［7］。我們發現Aβ能夠誘導PC12細胞內ROS積聚，MDA的產生，降低SOD、CAT和GSH-Px活力。三七總皂苷能夠抑制Aβ25－35誘導PC12細胞氧化應激。

我們進一步考察了三七總皂苷抑制Aβ25－35誘導PC12細胞氧化應激的分子機制。機體在抗氧化應激過程中產生了很多防御性機制，其中Nrf2/ARE信號通路的活化是重要環節。我們發現三七總皂苷明顯增加細胞核內Nrf2蛋白表達水平，并明顯上調HO-1的蛋白表達。而且，HO-1活力抑制劑SnPP預孵育則能抑制三七總皂苷介導的神經細胞保護作用。這些結果表明，三七總皂苷可能是通過活化Nrf2/ARE/HO-1信號通路，發揮神經細胞保護作用。但是，Nrf2從Keap1-Nrf2復合體中釋放的分子機制，需要后續實驗進行確證。

綜上所述，三七總皂苷能夠抑制Aβ25－35誘導的神經細胞氧化應激和凋亡，其作用機制可能是活化Nrf2/ARE信號通路，上調抗氧化酶HO-1的表達，但仍需進行體內外實驗進一步驗證三七總皂苷抗AD的藥效以及藥效作用機制。

〔致謝：本研究所有實驗均在中國醫學科學院、北京協和醫學院藥用植物研究所中藥（天然產物）創新藥物研發北京市重點實驗室進行。感謝汪夢霞同學及實驗室同學對實驗的幫助，以及孫桂波老師、孫曉波老師、趙自明老師和孟祥寶老師對本研究及文章的指導。〕

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Protective effect of Panax Notoginseng Saponins of Nrf2 signaling pathway on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25－35

ZHAO Jing-yu1，2，WANG Meng-xia1，2，ZHAO Zi-ming2，MENG Xiang-bao3，SUN Gui-bo3，SUN Xiao-bo3
（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2.Guangdong Province Municipal Institute of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510095，China；3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College；Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Bejing 100193，China）

Aim To investigate the protective effect of Panax Notoginseng Saponins（PNS）on Aβ25－35-in-duced apoptosis in PC12 cells and molecular mecha-nism.Methods The cell viability of PC12 cells was detected by MTT assay.The levels of LDH leakage，ROS，MDA，Caspase-3 activity and antioxidant enzyme activities of SOD，CAT，and GSH-Px activity were de-termined by respective kits.The apoptosis of cells was decteced by Western blot.Results PNS could signifi-cantly inhibit the decrease of cell viability and LDH leakage，reduce the production of MDA and ROS（P＜ 0.01），increase the activity of SOD，CAT and GSH-Px （P＜0.01），and the mitochondrial membrane poten-tial，inhibit the activation of caspase-3（P＜0.01）in PC12 cells which were induced by Aβ25－35.PNS could incrase nuclear Nrf2 and up-regulate HO-1.The neu-roprotective of PNS could be inhibited by HO-1 inhibi-tor ZnPP.Conclusion PNS may inhibit Aβ25－35-in-duced oxidative stress and apoptosis in PC12 cells by activating Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Alzheimer’s disease；panax notoginseng saponins；oxidative stress；apoptosis；Nrf2；HO-1

時間：2016－2－26 10：20 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160226.1020.020.html

10.3969/j.issn.1001－1978.2016.03.010

A

1001－1978（2016）03－0343－07

R284.1；R329.25；R349.1；R745.7；R977.6

2015－11－26，

2015－12－30

國家自然科學基金資助項目（No 81503290）；中醫藥行業科研專項（No 201507004）；國家重大創新藥創制專項（No 2012ZX09501001-004）

趙靜宇（1991－），女，碩士生，研究方向：中藥藥理學，E-mail：zhaojingyu1991＠126.com；孫桂波（1973－），女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學，E-mail：sunguibo＠126.com；孫曉波（1958－），男，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學，Tel/Fax：010-57833013，E-mail：xbsun＠implad.ac.cn