異常凝血酶原和唾液酸在慢性腎功能不全患者血清中的表達及臨床意義

公 帥，孫桂榮，劉明軍，席 強，彭 沖，孫曉嵐

(青島大學附屬醫院檢驗科，山東青島 266003)

·論 著·

異常凝血酶原和唾液酸在慢性腎功能不全患者血清中的表達及臨床意義

公 帥，孫桂榮△，劉明軍，席 強，彭 沖，孫曉嵐

(青島大學附屬醫院檢驗科，山東青島 266003)

目的 觀察慢性腎功能不全對血清異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)和唾液酸(SA)水平的影響。方法 用化學發光法和酶法分別檢測127例慢性腎功能不全、32例腎功能正常腎臟疾病患者、57例體檢健康者和120例肝細胞癌(HCC)患者血清PIVKA-Ⅱ和SA水平。分別測定上述受試者血清尿素(Urea)和肌酐(Cr)水平，并估算腎小球濾過率值(eGFR)。結果 健康對照組、腎功能正常疾病組和腎功能不全疾病組三組間血清PIVKA-Ⅱ水平沒有統計學差異(H=2.902,P>0.05)，且明顯低于HCC組(U值分別為319.50、203.00、665.50，P均<0.001)。腎功能不全疾病組中各期之間血清PIVKA-Ⅱ水平也沒有統計學差異(H=3.991,P>0.05)。血清SA水平在健康對照組、腎功能正常疾病組和腎功能不全疾病組之間 (H=63.685,P<0.001)，以及在腎功能不全疾病組各期之間(H=64.689，P<0.001)均有統計學差異。血清SA水平與eGFR呈負相關(r=-0.705,P<0.001)，與Urea、Cr水平呈正相關(r=0.599、0.704，P<0.001)。HCC組血清SA水平較CKD1～4期均明顯升高(U值分別為126.00、163.50、247.00、715.00，P均<0.001),較CKD5期無明顯變化(U= 419.00，P>0.05)。結論 腎功能不全對血清PIVKA-Ⅱ表達無明顯影響，但可明顯提高血清SA的表達水平，并與腎功能損害程度密切相關。可見血清SA水平升高不僅對HCC及其他多種惡性腫瘤有輔助診斷價值，還可較好地反映慢性腎功能不全患者的腎功能狀態。

慢性腎功能不全； 維生素K缺乏誘導蛋白; 唾液酸； 尿素; 肌酐

維生素K缺乏誘導蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)，又稱異常凝血酶原，是繼AFP臨床應用半個多世紀以來，又一個對肝細胞癌(HCC)的診斷、腫瘤分期、療效監測和預后判定均具有重要臨床價值的血清學標志物，敏感性和特異性高，與AFP聯合檢測可更早發現HCC[1-3]。也有學者報道炎癥性腸病和冠狀動脈鈣化患者的血清PIVKA-Ⅱ水平升高，同時可間接反映體內維生素K的缺乏[4-5]。據文獻報道，慢性腎病(CKD)患者往往伴有維生素K的缺乏[6]，其血清PIVKA-Ⅱ水平也升高，且升高程度隨腎功能損害程度的加重而逐漸升高[7]。但有學者對接受和未接受血液透析的兩組CKD患者血清PIVKA-Ⅱ水平進行研究發現[8-9]，腎功能及腎小球濾過率對血清PIVKA-Ⅱ的表達無明顯影響。有關中國慢性腎功能不全患者血清PIVKA-Ⅱ的表達情況尚不清楚。因此，有必要對中國人群血清PIVKA-Ⅱ水平與腎功能之間的相關性進行研究。

唾液酸(sialic acid，SA)是真核細胞膜上糖蛋白的主要成分，廣泛分布于哺乳動物體內，是一系列含有9個碳原子羥基化單糖酰化衍生物的統稱，通常位于糖蛋白和糖脂的寡糖側鏈的終端位置，是糖復合物結構和功能多樣化的重要物質基礎，在體內生物代謝過程中起著重要的生理功能，也與多種腫瘤的發生、發展密切相關，是一種非組織細胞特異性的腫瘤標志物[10-11]，其血清水平在老年慢性腎功能不全衰竭期患者表達升高[12]，但這種升高是否出現在腎功能不全的其他分期，是否與腎功能損害程度密切相關還缺乏文獻報道。

本研究以健康體檢者和腎功能正常疾病組患者分別為對照組，觀察腎功能不全各分期患者血清PIVKA-Ⅱ和SA水平變化，并分析兩者與eGFR、Urea和Cr水平的相關性，旨在探討腎功能對血清 PIVKA-Ⅱ和SA水平的影響。

1 資料與方法

1.1 對象與分組

1.1.1 腎功能不全疾病組：根據北京大學第一醫院推薦的中國人腎小球濾過率(GFR)公式求得GFR估算值(eGFR)[13-14]，選擇2014年9月至2015年3月本院住院的腎功能不全患者127例[eGFR<90 mL·min-1·(1.73 m2)]，男67例，女60例，年齡35～75歲，平均62歲，包括慢性腎小球腎炎23例，腎病綜合征41例，高血壓腎病42例，糖尿病腎病21例。又進一步依據美國KDOQI指南CKD的定義和分期對CKD患者分為如下4組：CKD 2期(腎功能輕度下降組)，eGFR 60～90 mL·min-1·(1.73 m2)，共32例；CKD 3期(腎功能中度度下降組)eGFR 30～59 mL·min-1·(1.73 m2)，共34例；CKD 4期(腎功能重度下降組)eGFR 15～29 mL·min-1·(1.73 m2)，共31例；CKD 5期(腎功能衰竭組)eGFR < 15 mL·min-1·(1.73 m2)，共30例。

1.1.2 腎功能正常疾病組 即CKD 1期，同期本院住院患者32例[eGFR>90 mL·min-1·(1.73 m2)]，男20例，女12例，年齡33～69歲，平均58歲，包括腎病綜合征12例，慢性腎小球腎炎10例，高血壓4例，糖尿病6例。

1.1.3 HCC組 另外收集2013年9月至2014年1月本院已確診為肝細胞癌患者120例，男106例，女14例，年齡40～77歲，平均57歲。

1.1.4 健康對照組 選取2013年9月至2014年1月本院體檢健康者57例，男37例，女20例，年齡41～68歲，平均56歲，體格檢查，臨檢常規及血生化檢查和影像學檢查均正常，排除常見內、外科疾病和代謝性疾病。上述4組間年齡差異無統計學意義(P>0.05),腎功能不全患者組和腎功能正常患者組均排除良惡性腫瘤及肝臟疾病。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會批準后實施。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 用普通真空采血管或促凝分離膠真空采血管采集受試者晨空腹靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，部分血清用于當天測定血清SA、Urea和Cr，部分血清 -20 ℃凍存，用于血清PIVKA-Ⅱ水平測定。

1.2.2 試劑與儀器 血清PIVKA-Ⅱ濃度測定采用日本富士瑞必歐株式會社生產的LUMIPULSETM G1200全自動免疫分析儀及配套PIVKA-Ⅱ試劑盒、標準品和質控品；血清唾液酸、Urea、Cr濃度測定均采用日本日立公司(Hitachi)生產的7600-210全自動生化分析儀；唾液酸測定試劑盒(酶法)、標準品及質控品均購自浙江東甌診斷產品有限公司；Urea、Cr試劑盒和標準品購自北京利德曼公司，質控品購自美國Beckman公司。

1.2.3 eGFR計算 記錄受試者的性別、年齡和血清Cr水平，根據北京大學第一醫院推薦的中國人腎小球濾過率(GFR)公式估算GFR值(eGFR)。公式為eGFR[mL/(min·1.73m2)]=186×[Scr(μmol/L)/88.4]-1.154×(年齡)-0.203×1.233(中國人)×0.724(女性)。

1.3 統計學處理 用SPSS 20.0軟件進行。血清SA、PIVKA-Ⅱ水平均呈偏態分布，用中位數(M)和第25、75百分位數(P25～P75) 表示；多組間數據比較采用非參數Kruskal-WallisH檢驗，組間的兩兩比較用Mann-WhitneyU檢驗。血清PIVKA-Ⅱ、SA水平與血清eGFR、Urea以及Cr水平間的相關性用直線相關分析。

2 結 果

2.1 各組血清PIVKA-Ⅱ和SA水平比較 經非參數Kruskal-WallisH檢驗，健康對照組、腎功能正常疾病組和腎功能不全疾病組3組間血清PIVKA-Ⅱ水平差異無統計學意義(H=2.902,P>0.05)，腎功能不全疾病組中各期之間血清PIVKA-Ⅱ水平差異無統計學意義(H=3.991,P>0.05)。HCC組血清PIVKA-Ⅱ水平較健康對照組、腎功能正常疾病組和腎功能不全疾病組均明顯升高(U值分別為 319.50、203.00、665.50，P均<0.001)。在健康對照組、腎功能正常疾病組和腎功能不全疾病組3組間血清SA水平差異有統計學意義(H=63.685,P<0.001)，腎功能不全疾病組血清SA水平明顯高于腎功能正常疾病組和健康對照組(U值分別為 769.50、1 278.50，P均<0.001)。其中，CKD 4期血清SA水平明顯高于CKD 2、3期(U值分別為172.00、265.00，P均<0.001)，明顯低于CKD5期(U=240.50，P<0.001)；CKD 3期血清SA水平明顯高于腎功能正常疾病組(U=298.50，P<0.001)和健康對照組(U=492.00，P<0.001 )；CKD 2期血清SA水平明顯高于健康對照組(U=584.50，P<0.001)，但與CKD3期(U=436.00,P>0.05)，以及腎功能正常疾病組比較(U=365.50,P>0.05)差異均無統計學意義；腎功能正常疾病組和健康對照組比較差異也無統計學意義(U=834.50,P>0.05)。HCC組血清SA水平與腎功能正常疾病組(U=126.00，P<0.001)和CKD 2、3、4期差異均有統計學意義(U值分別為163.50、247.00、715.00，P均<0.001),與CKD 5期差異無統計學意義(U=419.00，P>0.05)，見表1。

表1 各組血清PIVKA-Ⅱ和SA水平的比較[M(P25～P75)]

a：為與HCC組比較，P<0.001；b：為與健康對照組比較，P<0.001；c：為與腎功能正常疾病組比較，P<0.001；d：為與腎功能不全疾病組中的CKD 2期比較，P<0.001；e：為與腎功能不全疾病組中的CKD 3期比較，P<0.001；f：為與腎功能不全疾病組中的CKD 4期比較，P<0.001。

圖1 慢性腎功不全患者血清PIVKA-Ⅱ和SA水平與eGFR(a，d)、Urea(b,e)及Cr(c,f)水平的相關性分析(n=127)

2.2 慢性腎功能不全患者血清PIVKA-Ⅱ、SA水平與eGFR、Urea以及Cr水平間的相關性 經直線相關統計學分析，慢性腎病患者血清PIVKA-Ⅱ水平與血清eGFR、Urea以及Cr水平均無相關關系(相關系數r分別為0.166、-0.173、-0.128，P>0.05)。血清SA水平(Y,mg/dL)與eGFR[X,mL·min-1·(1.73 m2)]呈負相關(Y=-0.351X+78.573,r=-0.705,P<0.001)，與血清 Urea(X，mmol/L)呈正相關(Y=0.943X+51.37，r=0.599,P<0.001),與Cr水平(X，μmol/L)呈正相關(Y=0.03X+55.793，r=0.704,P<0.001)，見圖1。

3 討 論

凝血酶原是在維生素K依賴的γ谷氨酸羧化酶的催化作用下由其前體分子生成。當維生素K缺乏時，凝血酶原前體分子中谷氨酸區域的氨基酸因不能完全被羧化，則生成了異常凝血酶原，即PIVKA-Ⅱ。1984年Liebman等[15]學者首次發現PIVKA-Ⅱ在HCC患者血清中的濃度較健康者和慢性活動性肝炎患者明顯升高，近年隨著血清PIVKA-Ⅱ測定方法學的進步，以及檢測靈敏度和特異度的提高，使得該指標經美國FDA和CFDA批準作為HCC標志物應用于臨床。

Voong等[7]學者于2013年研究發現，慢性腎功能不全患者體內存在維生素K的缺乏,其中血液透析患者往往還伴有很嚴重的血管鈣化，此病理變化的產生認為與一種肝外產生的維生素K依賴基質Gla蛋白(MGP)的減少有關，該蛋白本身具有血管鈣化抑制作用。血管鈣化現象在腎病患者普遍存在，提示這些患者體內可能存在維生素K的缺乏或不足。Voong等[7]學者以腎小球濾過率(GFR)為腎功能的評價指標，觀察到血清PIVKA-Ⅱ水平隨GFR的下降而升高，血液透析患者血清PIVKA-Ⅱ水平升高更為顯著。Katots[8]認為PIVKA-Ⅱ的表達水平的升高并不是血液透析本身引起的，而是由于維生素K的缺乏，因為PIVKA-Ⅱ水平的升高往往與體內維生素K水平降低、患者年齡升高和HDL水平減少相一致，而與血液透析的治療時間沒有關系。本研究根據國人GFR公式求得eGFR，以此(評定腎臟疾病患者腎功能損害的程度，并根據eGFR將患者進行分組，研究結果顯示慢性腎功不全患者血清PIVKA-Ⅱ水平較腎功能正常疾病組和健康對照組無明顯變化，與Voong等[7]報道的研究結論不一致，究其原因目前尚難解釋，可能與彼此采取的腎功能評價指標以及研究對象的種族不同有關，本實驗采用的是GFR估算值(eGFR)，在評價腎功損害方面理論上不及GFR,但該值的測定簡單易行、成本低、適宜臨床廣泛應用；另外，不同種族飲食習慣的不同可能也決定腎功能不全患者的維生素K缺乏與否，況且維生素K缺乏引起的PIVKA-Ⅱ表達也是一個劑量和時間依賴性的過程[9-16]，腎病患者體內維生素K的缺乏也容易通過飲食補充得以糾正[7],只要慢性腎病患者保持一個良好的營養狀態(穩定的體重、沒有蛋白以及皮下脂肪的丟失等)，體內維生素K的含量往往可處于一個較高的水平[17]。

SA是細胞膜和可溶性蛋白的重要組分，對維護細胞的正常生理功能有重要作用，檢測血清SA濃度可間接反映細胞結構與功能。當組織發生炎癥反應、損傷或細胞代謝異常時，SA從細胞膜脫落或分泌增加，進入組織液或血流，引起血清SA水平的增高。多種惡性腫瘤細胞惡變過程中，細胞膜表面糖蛋白以及糖脂中糖基成分也發生如此變化，從而導致腫瘤患者血清SA水平也明顯升高[18-20]。本研究表明，腎功能不全疾病組血清SA水平明顯高于腎功能正常疾病組和健康對照組(P均<0.001)。腎功能不全疾病組中各期之間SA水平有顯著的統計學差異(P<0.001)。直線相關分析結果顯示血清SA水平與血清eGFR水平呈明顯的負相關，與血清Urea和Cr水平呈明顯的正相關，說明血清SA水平隨腎功能損害程度的加重而升高，這可能與腎臟疾病導致腎臟損害、腎小球毛細血管內皮損傷以及管型形成，腎衰時大量的腎小管纖維變性和壞死，大量的SA釋放入血有關。HCC組血清SA水平明顯高于腎功能正常疾病組和腎功能不全疾病組，提示SA可作為肝癌輔助診斷指標。在排除惡性腫瘤的情況下，血清SA水平的變化對腎臟疾病的病情判斷和療效觀察也具有良好的指導作用。

綜上，本實驗未發現腎功能不全對血清PIVKA-Ⅱ水平有明顯的影響，臨床應用PIVKA-Ⅱ作為HCC及其他惡性腫瘤的標志物時可忽略腎功能對其的影響，但發現對血清SA水平有明顯的升高作用，且與腎功能損害程度有關。目前SA作為腫瘤標志物在臨床上廣泛應用，臨床醫生面對陽性結果檢驗報告時應注意排除腎功能改變引起的假性升高。對非惡性腫瘤患者，血清SA水平檢測也有望成為監測慢性腎病病情變化的有用指標。

[1]Marrero JA,Su GL,Wei W,et al.Des-gamma carboxyprothrombin can differentiate hepatocellular carcinoma from nonmalignant chronic liver disease in American patients[J].Hepatology,2003,37(5):1114-1121.

[2]Lamerz R,Runge M,Stieber P,et al.Use of serum PIVKA-Ⅱ(DCP) determination for differentiation between benign and malignant liver diseases[J].Anticancer Res,1999,19(4A):2489-2493.

[3]席強,孫桂榮,叢培珊,等.血清異常凝血酶原和甲胎蛋白聯合檢測對原發性肝癌的臨床價值[J].中華檢驗醫學雜志,2014,37(12):928-932.

[4]Nakajima S,Iijima H,Egawa S,et al.Association of vitamin K deficiency with bone metabolism and clinical disease activity in inflammatory bowel disease[J].Nutrition,2011,27(10):1023-1028.

[5]Shea MK,O′Donnell CJ,Vermeer C,et al.Circulating uncarboxylated matrix gla protein is associated with vitamin K nutritional status,but not coronary artery calcium,in older adults[J].J Nutr,2011,141(8):1529-1534.

[6]McCabe KM,Adams MA,Holden RM,et al.Vitamin K status in chronic kidney disease[J].Nutrients,2013,5(11):4390-4398.

[7]Voong K,Harrington D,Goldsmith D,et al.Vitamin K status in chronic kidney disease:a report of a study and a mini-review[J].International Urology and Nephrology,2013,45(5):1339-1344.

[8]Kato A,Yasuda H,Togawa A,et al.Measurement of des-gamma-carboxy prothrombin levels in hemodialysis patients positive for anti-hepatitis virus C antibody[J].Clinical Nephrology,2002,58(4):296-300.

[9]Stankowiak-kulpa H,Krzyzanowska P,Koziol L,et al.Vitamin K status in peritoneally dialyzed patients with chronic kidney disease[J].Acta Biochimica Polonica,2011,58(4):617-620.

[10]Ros-Bullón MR,Sánchez-Pedreno OP,Martínez-Liarte JH，et al.Serum sialic acid in malignant melanoma patients:an ROC curve analysis[J].Anticancer Res,1999,19(35):3619-3622.

[11]Tewarson SL,Mittal VP,Singh M,et al.Serum sialic acid-an important cancer marker[J].Indian J Cancer,1993,30(3):125-131.

[12]李彪英,王玉生,常玉正,等.老年慢性腎功能衰竭患者血清唾液酸和脂蛋白(a)的測定[J].臨床薈萃,2003,18(3):132-133.

[13]Ma YC1,Zuo L,Chen JH,et al.Modified glomerular filtration rate estimating equation for Chinese patients with chronic kidney disease[J].J Am Soc Nephrol,2006,17(10):3927-3944.

[14]布海霞,程李濤,張愛華,等.慢性腎臟病門診患者單純收縮期高血壓與腎臟病分期的關系[J].中華腎臟病雜志,2015,31(1):19-23.

[15]Liebman HA,Furie BC,Tong MJ,et al.Des-gamma-carboxy (abnormal) prothrombin as a serum marker of primary hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med,1984,310(13):1427-1431.

[16]Okuda H,Obata H,Nakanishi T,et al.Production of abnormal prothrombin des-gamma-carboxy prothrombin by hepatocellular carcinoma.A clinicaland experimental study[J].J Hepatol,1987,4(3):357-363.

[17]Holden RM,Morton AR,Garland JS,et al.Vitamins K and D status in stages 3-5 chronic kidney disease[J].Clin J Am Soc Nephrol,2010,5(4):590-597.

[18]Ghosh S.Sialic acids:biomarkers in endocrinal cancers[J].Glycoconi J,2015,32(1):79-85.

[19]Dadhich M,Prabhu V,Pai VR,et al.Serum and salivary sialic acid as a biomarker in oral potentially malignant disorders and oral cancer[J].Indian J Cancer,2014,51(3):214-218.

[20]Li PL,Zhang X,Li TF,et al.Combined detection of sialic acid and hydroxyproline in diagnosis of ovarian cancer and its comparison with human epididymis protein 4 and carbohydrate antigen 125[J].Clin Chim Acta，2015,439(2):148-153.

Serum expression of PIVKA-Ⅱand SA in patients with chronic renal insufficiency

GongShuai,SunGuirong△,LiuMingjun,XiQiang,PengChong,SunXiaolan

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China)

Objective To investigate the impact of chronic renal insufficiency on serum levels of protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ(PIVKA-Ⅱ) and sialic acid (SA).MethodsThe levels of serum PIVKA-Ⅱ,SA,urea and creatinine(Cr) were detected in 127 cases of chronic renal insufficiency,32 cases of renal disease with normal renal function,57 healthy controls undergoing the physical examination and 120 cases of hepatocellular carcinoma(HCC) by using the chemiluminescent and enzymatic methods respectively.The serum urea and creatinine levels were also measured.The estimated GFR (eGFR) was calculated.Results The serum PIVKA-Ⅱ level had no statistical difference in among the healthy control group,renal disease with normal renal function group and renal disease with renal insufficiency group(H=2.902,P>0.05),moreover significantly lower than that in the HCC group (U=319.5，203.00,665.50 respectively,P<0.001).Serum PIVKA-Ⅱ level had no statistical difference among various stages in the disease with renal insufficiency group (H=3.991，P>0.05).However,serum SA levels had statistical differences among the healthy control group,disease complicating normal renal function group and disease complicating renal insufficiency group( H = 63.685，P<0.001),and among the various stages in the disease complicating renal insufficiency group (H=64.689,P<0.001).The serum SA level was negatively correlated with eGFR level (r=-0.705，P<0.001),and positively correlated with Urea and Cr levels (r= 0.599，r= 0.704，P<0.001).The SA level in the HCC group was significantly increased compared with that in the stage 1-4 of chronic kidney disease(CKD) (U=126.00，163.50,247.00,715.00 respectively,P<0.001),but had no obvious change compared with the stage 5 of CKD(U=419.00,P>0.05).Conclusion The renal insufficiency has no obvious impact on serum PIVKA-Ⅱexpression,but could significantly increase the SA expression level,moreover is closely related with the severity of renal function impairment,thus indicating that the SA level increase not only has the assisted diagnosis value on HCC and multiple malignant tumors,but also better reflects the renal function status in the patients with chronic renal insufficiency.

chronic renal insufficiency; PIVKA-Ⅱ; sialic acid; urea; creatinine

公帥，男，在讀研究生，主要從事臨床免疫學檢驗研究。△通訊作者，E-mail：sungr@qduhospital.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.013 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0900-04

2015-11-10)