抗體減半及延長標本保存時間對流式細胞術檢測HLA-B27影響因素的探討

許文艷，楊 麟，歐陽雁

(昆鋼醫院檢驗科，云南昆明 650302)

·經驗交流·

抗體減半及延長標本保存時間對流式細胞術檢測HLA-B27影響因素的探討

許文艷，楊 麟，歐陽雁

(昆鋼醫院檢驗科，云南昆明 650302)

目的 研究流式細胞儀(FCM)檢測外周血人類白細胞抗原B27(HLA-B27)時抗體用量及標本保存時間對HLA-B27陽性細胞百分比的影響。方法 應用Beckman Coulter FC500流式細胞儀檢測患者外周血HLA-B27陽性細胞百分比，并應用SPSS19.0軟件對抗體減量和保存時間對檢測結果的進行分析。結果 抗體減半及樣本保存至7 d檢測外周血HLA-B27陽性細胞百分比結果差異無統計學意義(P>0.05)。結論 FCM分析HLA-B27時抗體用量減半及適當延長標本保存時間至7 d，對檢測HLA-B27陽性細胞百分比無明顯影響。

流式細胞術； 人類白細胞抗原B27； 強直性脊柱炎；

流式細胞儀是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析的檢測手段，可以同時分析上萬個細胞，并能從中測得多個參數。目前流式細胞分析已普遍應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎研究領域[1]。應用流式細胞儀來測定人類白細胞抗原27(HLA-B27)的表達，具有操作簡單，靈敏度和特異性較高，結果穩定等特點。但HLA-B27抗體價格比較昂貴，臨床標本數量少,需集中保存后統一檢測。為高效合理使用抗體和集中統一檢測標本，我們用抗體減半以及延長保存時間至7 d分別檢測33例患者及12例患者的HLA-B27陽性細胞百分比，探討抗體減半，延長標本保存時間對檢測HLA-B27陽性細胞百分比的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集 2015年10～11月收集來自云南昆鋼醫院疼痛科、風濕免疫科及康復科門診就診及住院疑患者，采集上述人員空腹靜脈血2 mL，以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

1.1.2 儀器與試劑 流式細胞儀型號：Beckman Coulter FC500；FLow-CheckTM熒光微球；HLA-B27FITC/ HLA-B7-PE抗體；同型對照為IgG2a- FITC/IgG-PE；溶血劑為OptiLyse C Lysing Solution；以上試劑均購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 收集33例(其中包含9例HLA-B27陽性和24例HLA-B27陰性)待測標本，根據使用HLA-B27的抗體劑量不同分為兩組，分別檢測HLA-B27陽性細胞百分比。(1)10 μL組：在試管中加入10 μL抗體，依次加入50 μL抗凝血，充分混勻后分別避光靜置20 min，加入300 μL溶血劑并立即渦旋混勻，室溫避光10 min后3 000 r/min離心5 min，棄上清液后加2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清液,加500 μL PBS平衡5 min后上機檢測；(2)20 μL組：在試管中加入 20 μL抗體，依次加入100 μL抗凝血，充分混勻后分別避光靜置20 min，加入500 μL溶血劑并立即渦旋混勻，室溫避光10 min后3 000 r/min離心5 min，棄上清液后加2 mL PBS洗滌后棄上清液,加500 μL PBS平衡5 min后上機檢測。

1.2.2 收集12例(其中包含6例HLA-B27陽性和6例HLA-B27陰性)待測標本，根據標本保存時間分為兩組；0 d檢測組：標本按10 μL組的操作流程當天上機進行檢測；7 d檢測組：標本放置于4 ℃冰箱保存7 d后按10 μL組的操作流程上機檢測。

2 結 果

2.1 抗體減量對HLA-B27陽性細胞百分率的影響 結果表明，抗體減半與抗體全量檢測HLA-B27陽性細胞百分比差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同劑量類型B27陽性率比較

2.2 保存時間對檢測結果的影響 結果表明，當天與樣本4℃保存1周檢測HLA-B27陽性細胞百分比差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同檢測時間B27陽性率比較

3 討 論

強直性脊柱炎(AS)是脊柱及附屬組織的自身免疫性疾病，主要累及骶髂關節、脊柱、脊柱骨軟組織及四肢關節。流行病學研究證實AS患者中96%具有HLA-B27，而健康者僅有7%，從發病到明確診斷往往需要4～10年[2]。AS最初起病隱匿，患者脊柱或周圍關節疼痛往往與其他原因引起的脊柱或關節疼痛癥狀相似而又沒有骶髂關節炎的明確表現。因此，在臨床上不宜確診，僅以X線所見為依據，可能對一些早期病例的診斷不可靠，如果患者根據臨床資料診斷AS的概率為50%，在檢出HLA-B27時則可提高至93%，因而，結合患者癥狀與臨床上其他診斷進行HLA-B27檢測具有十分重要的意義[3]。流式細胞術是根據直接熒光染色的原理，利用熒光標記的抗B27的單克隆抗體和淋巴細胞表面的B27抗原結合，使細胞具有一定的熒光強度，這種熒光強度可被流式細胞儀測得的通道值反映。根據通道值的高低判斷B27抗原陽性或陰性[4]。該方法操作簡單、結果準確，尤其適用于大規模樣本檢驗。本研究對抗體用量減半和抗凝標本保存7 d對HLA-B27陽性細胞百分率的結果進行了探討,結果表明，抗體減半以及標本保存至7天對HLA-B27陽性細胞百分率的檢測結果沒有影響，為醫院高效利用抗體和集中收集樣本后統一進行檢測提供方便,在臨床工作中具有實際意義。

[1]王建中．臨床流式細胞分析[M]．上海：上海科學技術出版社，2005：169-172．

[2]黎勤云，李志強．強直性脊柱炎相關HLA-B27的研究進展[J]．中國輸血雜志，2012，25(11)：1138-1140．

[3]李娜，高文波，周玉明．流式細胞術檢測 HLA-B27最佳抗體劑量與作用時間研究[J]．國際檢驗醫學雜志，2015，36(20)：2965-2966．

[4]李維，府偉靈，王芳，等．流式細胞術檢測98例獻血者外周血HLA-B27的臨床意義[J]．第三軍醫大學學報，2003，25(8)：727-729．

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.065 文獻標識碼：B 文章編號：1673-4130(2016)07-1008-02

2015-11-13)