痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用機制

李珍，葉志華，馮娟娟

(河南省人民醫院，鄭州450008)

·基礎研究·

痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用機制

李珍，葉志華，馮娟娟

(河南省人民醫院，鄭州450008)

目的 觀察痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果，并探討其作用機制。方法 選擇C57BL/6小鼠50只，隨機分為空白組、模型組、順鉑組、痰熱清組及順鉑聯合痰熱清組。除空白組外，其余組建立Lewis肺癌模型。接種Lewis肺癌瘤株后1天，順鉑組隔天腹腔注射1.5 mg/kg順鉑，痰熱清組腹腔注射3.5 mL/kg痰熱清注射液，順鉑聯合痰熱清組腹腔注射等量順鉑、痰熱清注射液；空白組、模型組腹腔注射等量生理鹽水。各組連續給藥2周。測量小鼠接種后5、7、10、14天腫瘤體積，計算腫瘤抑制率。末次給藥后，檢測股骨骨髓細胞(BMC)計數及外周血WBC、RBC、PLT，并檢測小鼠血清血管內皮生長因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內皮抑素(ES)、IL-2、TNF-α、IFN-γ水平。結果 接種14天，與模型組比較，順鉑組、痰熱清組、順鉑聯合痰熱清組腫瘤體積縮小(P<0.05或<0.01)，且順鉑聯合痰熱清組效果更明顯。順鉑聯合痰熱清組腫瘤抑制率明顯高于順鉑組和痰熱清組(P<0.05或<0.01)。與模型組比較，順鉑聯合痰熱清組BMC、WBC、RBC、PLT明顯降低(P<0.05或<0.01)，但均高于順鉑組、均低于痰熱清組(P<0.05或<0.01)。與空白組比較，模型組血清VEGF、TNF-α水平明顯升高，AS、ES、IL-2、IFN-γ明顯降低(P均<0.01)。與模型組比較，順鉑聯合痰熱清組血清VEGF、TNF-α明顯降低，AS、ES、IL-2、IFN-γ明顯升高(P<0.05或<0.01)。與順鉑組比較，順鉑聯合痰熱清組血清VEGF更低，AS、ES、IL-2更高(P均<0.01)，與痰熱清組比較，順鉑聯合痰熱清組VEGF、TNF-α更高，AS、ES、IL-2、IFN-γ更低(P均<0.01)。結論 痰熱清注射液輔助化療能改善Lewis肺癌小鼠外周血細胞異常，增強免疫功能，抑制腫瘤生長；其機制可能與降低血清VEGF、TNF-α，升高AS、ES、IL-2、IFN-γ水平有關。

肺癌；痰熱清注射液；免疫功能；內皮生長因子；血管抑素；小鼠

腫瘤擴散、轉移與血管形成有關，其血管形成受體內多種因素調控，如內皮生長因子、血管抑素等[1～3]。痰熱清注射液為一種中藥制劑，具有清熱、化痰、解毒之功效， 臨床主要用于風溫肺熱病痰熱阻肺證。研究表明，痰熱清注射液在抑制肺癌生長、穩定和控制病灶、延緩復發轉移方面有一定的作用[4,5]。2014年2月～2015年8月，我們觀察了痰熱清注射液聯合化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用，現分析結果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級C57BL/6小鼠56只，4周齡，雌雄各半，體質量18～22 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(冀)2010-0038。Lewis肺癌瘤株，由軍事醫學科學院提供。LD-5M立式低速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；精密移液器，端士Socorex公司；BIO-RAD酶標儀Xmark，美國BIO-RAD伯樂公司；DW-86L626型低溫冰箱，青島海爾股份有限公司。痰熱清注射液(批號：1107114)，上海凱寶藥業有限公司；順鉑(批號：2030111DB)，齊魯制藥公司；小鼠VEGF試劑盒(批號：HTAC017)、ES試劑盒(批號：HTAC023)、AS試劑盒(批號：HTAC011)、IL-2試劑盒(批號：HTAC012)、TNF-α試劑盒(批號：HTAC009)、IFN-γ試劑盒(批號：HTAC015)，均為ELISA試劑盒，由Andy-gene公司提供。

1.2 模型制備 參照文獻[6]方法建立Lewis肺癌小鼠模型。37 ℃溫水復蘇Lewis肺癌瘤株，調整瘤株密度至1×107/mL。取0.1 mL接種于2只小鼠右腋皮下；接種第11天，將小鼠以脫頸方式處死，取生長良好的癌組織，洗凈，剪碎，研磨，調整腫瘤細胞密度至1×107/mL，再次接種于小鼠，重復上述操作。參照上述方法將接種3次的腫瘤細胞接種于40只小鼠右腋皮下。

1.3 動物分組及處理 取荷瘤小鼠40只，隨機分為模型組、順鉑組、痰熱清組、順鉑聯合痰熱清組，每組10只。另取未制模小鼠10只作為空白組。接種Lewis肺癌瘤株后1天，順鉑組隔天腹腔注射順鉑1.5 mg/kg；痰熱清組腹腔注射痰熱清注射液3.5 mL/kg，順鉑聯合痰熱清組應用順鉑、痰熱清注射液，劑量及用法分別同順鉑組及痰熱清組；空白組、模型組腹腔注射等量生理鹽水。各組連續給藥2周。造模過程中或給藥過程中部分小鼠死亡，最終空白組、模型組、順鉑組、痰熱清組、順鉑聯合痰熱清組剩余小鼠分別為9、8、7、9、8只。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 腫瘤體積及抑瘤率 模型組、順鉑組、痰熱清組、順鉑聯合痰熱清組接種后5、7、10、14天，采用動物腫瘤測量跟蹤系統，電子數顯卡尺測量腫瘤最長徑、最短徑(cm)，腫瘤體積=腫瘤最長徑×最短徑×最短徑/2，計算腫瘤抑制率=(腫瘤體積-模型組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積×100%。

1.4.2 外周血細胞及股骨骨髓細胞(BMC)數量 取小鼠股動脈血0.5 mL，采用流式細胞儀計數外周血WBC、RBC、PLT；待小鼠處死后，剪取小鼠股骨，PBS沖洗骨髓腔，4 000 r/min離心15 min，棄上清，加入PBS混勻。光鏡下于計數板上計數單根股骨全部骨髓細胞(BMC)。

1.4.3 血清相關細胞因子檢測 取小鼠股動脈血，靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，取上清，低溫保存，備用。采用酶標儀，ELISA法檢測外周血血管內皮生長因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內皮抑素(ES)、IL-2、TNF-α、IFN-γ水平。嚴格按試劑盒說明步驟檢測。

2 結果

2.1 各組腫瘤體積及抑制率比較 見表1。

表1 各組不同時間腫瘤體積及腫瘤抑制率比較±s)

注：與模型組同時間點比較，#P<0.05，##P<0.01；與順鉑組同時間點比較，△P<0.05，△△P<0.01；與痰熱清組同時間點比較，*P<0.05，**P<0.01。與同組接種5天比較，▲▲P<0.01；與同組接種7天比較，○P<0.05；與同組接種10天比較，◆P<0.05。

2.2 各組外周血細胞及BMC數量比較 見表2。

2.3 各組血清相關細胞因子水平比較 見表3。

表2 各組外周血細胞及BMC數量比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與痰熱清組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01。

表3 各組血清相關細胞因子水平比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與痰熱清組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01。

3 討論

肺癌的早期發現率較低，臨床上多數患者就診時病情已屬中晚期，治愈率極低。化療是肺癌的主要治療方法，90%以上的肺癌需要接受化療，但化療除能殺死腫瘤細胞外，對人體正常細胞及免疫功能也有損害[7，8]。近年來，中藥復方制劑作為生物調節劑已用于惡性腫瘤的綜合治療，以低毒、廉價、高效等優勢受到越來越多的關注。

痰熱清注射液的主要成分為黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹等，具有清熱、化痰、解毒之功效，可增強機體的免疫功能。痰熱清注射液在臨床輔助治療腫瘤方面有一定的成效。耿秀艷等[9]報道，婦科腫瘤老年患者術后給予痰熱清注射液霧化吸入可增強患者的免疫功能。楊旭初等[10]報道，肺癌患者應用痰熱清注射液可減少放射性肺炎及放射性肺纖維化的發生。李永偉等[11]報道，痰熱清注射液可改善原發性肝癌肝動脈栓塞化療術后患者栓塞綜合征的發生，患者發熱持續時間縮短。本研究結果顯示，接種腫瘤細胞第14天，與模型組比較，順鉑組、痰熱清組、順鉑聯合痰熱清組腫瘤體積均明顯縮小，但順鉑聯合痰熱清組體積明顯小于、抑瘤率明顯高于順鉑組、痰熱清組，提示痰熱清注射液具有增強順鉑抑制腫瘤生長的作用。

骨髓是淋巴細胞發育、分化成熟的主要場所之一，與機體的抗腫瘤免疫功能密切相關，在化療過程中，骨髓極易受到損傷，而骨髓細胞數量可反映機體免疫功能狀態及淋巴細胞的發育狀態。本研究中，與模型組比較，順鉑聯合痰熱清組BMC、WBC、PLT、RBC明顯降低，但均高于順鉑組、低于痰熱清組，提示順鉑聯合痰熱清能保護化療小鼠的骨髓，促進淋巴細胞分化、發育及發揮免疫活性，進而增強淋巴細胞的抗腫瘤免疫應答。

IFN-γ是典型的Th1類細胞因子，TNF-α由巨噬細胞及活化T細胞產生，二者均可促進抗原提呈細胞對腫瘤抗原的提呈及細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的識別，在機體抗腫瘤免疫中發揮重要作用[12,13]。IL-2能夠誘導干擾素和多種細胞因子的分泌，是免疫調節的中心環節，能促進Fas抗原的表達，促進細胞凋亡[14]。馬鳴等[15]研究證實，痰熱清注射液對化療造成的機體免疫功能損傷有明顯的保護作用，并對機體抗腫瘤免疫有明顯的促進作用。本研究結果顯示，與模型組比較，順鉑聯合痰熱清組血清TNF-α明顯降低，IL-2、IFN-γ明顯升高；與順鉑組比較，順鉑聯合痰熱清組的IL-2更高；與痰熱清組比較，順鉑聯合痰熱清組TNF-α更高，IL-2、IFN-γ更低；這說明IFN-γ、TNF-α、IL-2可增強淋巴細胞抗腫瘤免疫活性，從而改善腫瘤患者機體的免疫狀態。與痰熱清組比較，順鉑聯合痰熱清組IFN-γ、IL-2更低，TNF-α、VEGF更高，說明痰熱清與順鉑二者具有協同作用，聯合應用可更好地改善腫瘤患者機體的免疫狀態。

血管生成促進因子VEGF主要通過影響血管內皮細胞的 PI3K 等信號通路而發揮調控作用[16]；血管生成抑制因子主要包括AS、ES，AS主要通過抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖、遷移來發揮其抗腫瘤作用[17]；而ES具有廣泛的抗癌活性，能干擾新的血管生成，是最有效的內源性血管生長抑制劑之一[18]。本研究結果顯示， 與順鉑組比較，順鉑聯合痰熱清組血清VEGF更低，AS、ES更高；與痰熱清組比較，順鉑聯合痰熱清組血清VEGF更高，AS、ES更低；說明順鉑聯合痰熱清抑制VEGF、上調AS、ES水平的效果優于順鉑。與痰熱清組比較，順鉑聯合痰熱清組血清AS、ES更低，VEGF更高，提示痰熱清與順鉑聯合抑制腫瘤生長的效果更加明顯，兩者協同對腫瘤產生抑制作用。

綜上所述，熱清注射液能夠改善Lewis肺癌小鼠外周血細胞異常，增強免疫功能，抑制腫瘤生長，可能與調控血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、VEGF、ES及AS水平密切相關。

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國家自然科學基金資助項目(81001103)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.008

R734.2

A

1002-266X(2016)20-0025-04

2015-11-11)