甘草次酸對人胃癌HGC－27的抑制增殖和誘導凋亡作用①

賈洪巖，林　芳，王立敏，劉　丹

(1.沈陽藥科大學基于靶點的藥物設計與研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽110000;2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

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甘草次酸對人胃癌HGC－27的抑制增殖和誘導凋亡作用①

賈洪巖1，2，林芳1，王立敏2，劉丹1

(1.沈陽藥科大學基于靶點的藥物設計與研究教育部重點實驗室，遼寧沈陽110000;2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江佳木斯154007)

摘要:目的:研究18β－甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)對人胃癌細胞HGC－27生長抑制作用及對細胞凋亡的影響。方法:分別以12.5、25、50、100和200 μM的GA處理HGC－27細胞，MTT法檢測不同時間點(24、48和72h)的細胞增殖抑制率，以AO/EB法初步觀察GA誘導HGC－27凋亡的情況，以Annexin V－FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡率確定凋亡的發生。結果: GA能抑制HGC－27細胞生長，且呈劑量依賴性，GA可以引起HGC－27細胞核皺縮、染色質濃縮、細胞膜發泡、等凋亡特征，提示了凋亡的參與，通過Annexin V/PI雙染色法最終確定GA可劑量依賴性地引起HGC－27的凋亡。結論: GA可抑制人胃癌細胞HGC－27增殖，其作用機制可能與GA引起HGC－27凋亡有關。

關鍵詞:甘草次酸; HGC－27細胞;細胞凋亡

胃癌是一種嚴重威脅人類健康的疾病，在許多惡性腫瘤當中，其發病率高居第二位。在臨床上，利用Ki－67、RAB5A、VHL、Survivin以及HGF等的表達情況來診斷早期胃癌的發生［1～3］。多數早期胃癌的治療均采取局部切除的方法，而對于晚期胃癌，手術切除后仍有復發或轉移的可能，其術后5年生存率始終保持在30%左右。近幾年的研究表明，中藥不管是在腫瘤的早期或者中期作為手術、化療以及介入治療的一種輔助手段，還是在腫瘤的晚期由于患者失去了最佳手術機會且對化療的耐受力下降或者進行介入治療時其作為一種必要的治療手段均在臨床上表現出了優越的效果［4，5］。18β－甘草次酸是中草藥甘草的一種重要有效成分。現代藥理學研究表明，甘草次酸具有調節免疫系統、抗肝毒素、抗腫瘤、抗潰瘍、抗病毒以及抗炎等多種生理活性［6～9］。GA對一些腫瘤細胞生長具有一定的抑制作用［10，11］，有關甘草次酸對胃癌細胞HGC－27生長作用的報道較少，對其抗腫瘤的確切機制亦不清楚，本研究觀察甘草次酸對胃癌細胞系HGC－27細胞生長的抑制作用，探討其可能的作用機制，為胃癌的臨床治療提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

藥品與主要儀器: GA:購于Sigma公司; CO2培養箱:德國賀利氏公司;酶標儀:美國Bio－Rad公司;熒光顯微鏡:德國Leica公司;流式細胞儀:美國Becton Dickson公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養

HGC－27細胞培養于含10 %胎牛血清100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、0.2% NaHCO3的RPMI－1640培養液中的中，置于37℃、5 % CO2的培養箱中培養，0.25 %的胰酶消化傳代。

1.2.2顯微鏡下細胞形態的觀察

取對數生長期的細胞進行消化傳代，并且在培養24h后加入甘草次酸終濃度為25、50、100μM的培養液連續培養24h后置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.3 MTT法

細胞生長至培養皿的80%時棄去培養液，在消化和離心后收集細胞，加入新鮮的培養液，慢慢吹打培養液使其成單細胞懸液;之后將單細胞懸液稀釋至細胞數為2×105個/mL，吹均勻后，將96孔板中的每孔加入100μL的單細胞懸液，然后放于培養箱中，24h后加藥處理，每個濃度設置四個復孔，與細胞共同孵育24h、48h和72h后，每孔分別加入50μL 2mg/mL的MTT溶液，于培養箱中繼續孵育4h;甩板后倒扣于濾紙上，在濾紙充分吸干殘留的液體后，每孔分別加入200μL的DMSO，然后放于振蕩器上振蕩10min以使得藍色結晶物溶解;用酶標儀在570nm處測其吸光度值，設200μL DMSO為空白對照。

由以下公式計算細胞生長的抑制率:

抑制率(%) = 1－(對照細胞OD值－加藥細胞OD值) /對照細胞OD值×100%

將藥物濃度的對數值與細胞的存活率作線性回歸，可求出藥物對腫瘤細胞的半數生長抑制濃度及IC50值。

1.2.4 AO/EB雙染熒光試驗

取處于對數生長期的HGC－27細胞，以每孔的細胞密度為2×105個/mL接種于24孔板中，每孔800μL。然后分別用濃度為25、50、100μM的藥物處理后，收集細胞，離心，棄去上清液，重懸于100μL 的PBS中，然后加入AO/EB等體積混合液16μL (100 μg/mL AO，100μg/mL EB)，混勻后，吸一滴混合液于潔凈的載玻片上，用蓋玻片封片，放于熒光顯微鏡下觀察并拍照。EB拒染并出現細胞膜發芽、發泡、核皺縮以及凋亡小體的細胞則被認為是凋亡細胞。

1.2.5 Annexin V－FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡

在36 h時收集各組的HGC－27細胞，用PBS洗滌2次，按Annexin V－FITC /PI試劑盒的說明書操作。在1h內利用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，采用Cell Quest V 3.2軟件來獲取和分析數據。

2　結果

2.1細胞形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察對照組細胞生長旺盛，形態成梭形或者多邊形，貼壁生長牢固，折光率較高，細胞膜生長完整。甘草次酸處理過的HCG－27細胞隨著濃度的增加增殖變慢且細胞逐漸變小變圓，折光變差等，部分細胞漂浮在培養瓶中。甘草次酸濃度越高，上述表現越明顯。見圖1。

A.對照; B.甘草次酸25μM; C.甘草次酸50μM; D.甘草次酸100μM圖1　不同濃度GA作用24 h后顯微鏡觀察細胞變化

A.對照; B.甘草次酸25 μM; C.甘草次酸50 μM; D.甘草次酸100 μM圖2　AO/EB檢測不同濃度GA作用48 h后HGC－27形態變化

2.2 GA對HGC－27細胞生長抑制情況

分別以12.5、25、50、100和200μM的GA處理HGC－27細胞，MTT法檢測不同時間點(24、48和72h)的細胞增殖抑制率，GA隨著作用時間的增加對HGC－27有一定的生長抑制作用，并且隨著時間的延長具有時間依賴性，見表1。

表1　藥物處理不同時間GA對HGC－27的IC50

2.3 GA對HGC－27的AO/EB染色結果

通過對先前細胞的形態學變化和GA對HGC－27的抑制作用，提示GA對HGC－27可能具有促進凋亡的作用，而細胞凋亡時，形態學的變化是重要的特征之一。圖2是不同濃度的GA作用在HGC－27細胞48h后熒光染色的結果。對照組細胞的細胞核形狀規則，染色均一。而GA處理組隨著濃度的升高出現了細胞核皺縮、染色質濃縮、細胞膜發泡、邊緣化等明顯的凋亡形態學改變。

2.4細胞凋亡改變

Annexin V－FITC/PI雙染色后流式細胞儀檢測結果顯示，對照組及25、50、100 μM的GA作用36h后早期凋亡率分為別0.72%、1.06 %、9.5%、17.58%。與對照組相比證明GA可以誘導HGC－27早期凋亡，見圖3。

A對照組B 25 μM組C 50 μM組D 100 μM組圖3　不同濃度GA作用36 h后HGC－27細胞流式凋亡分析

3　討論

通過光學顯微鏡我們初步觀察到GA可以抑制胃癌細胞HGC－27生長，MTT法檢測GA對HGC－27細胞72h的IC50為59.32μM，根據細胞形態，憑經驗推測可能有凋亡發生，繼續采用AO/EB法初步提示凋亡確實存在。進而，Annexin V－FITC/PI法用來檢測細胞早期凋亡時膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，該指標一直作為細胞凋亡判斷的金指標，我們的實驗結果證實了GA確實誘導了凋亡，且呈劑量依賴性。與文獻報道GA具有多種抗腫瘤活性相一致，GA具抗惡性胃癌細胞的作用，我們認為在治療和預防早期胃癌可能有應有前景。有報道稱，如果可以聯合用藥的幾種藥物之間存在協同效應，那么其不僅可以減輕藥物副作用，同時可以增強藥物的療效［6］。甘草次酸屬于較溫和的天然產物，安全性高，高振北等［12］報道，全反式維甲酸與甘草次酸聯合應用，則可以協同抑制PGCL3細胞(人肺癌細胞)的侵襲和轉移。本文發現甘草次酸單獨應用有一定抗胃癌效果，這為開發其和相關藥物聯用研究提供了一定的參考價值。但其具體作用機制還有待進一步研究。開發甘草次酸與其他藥物合用治療胃癌，可能更具有臨床價值。

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(收稿日期:2015－05－24)

通訊作者:王立敏(1973～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E－mail: wlmtong@163.com。

作者簡介:①賈洪巖(1990～)女，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生。

中圖分類號:R735.2

文獻標識碼:A

文章編號:1008－0104(2016) 02－0088－03