跑臺運動通過上調前額葉皮質BDNF表達改善慢性應激大鼠的抑郁行為

崔建梅，藥宏慧，于　芳，薄媛媛，蘇曉云，龐立杰

(1．中北大學 體育學院， 山西 太原　030051；2．太原學院 體育系， 山西 太原　030051；3. 山西醫科大學 汾陽學院， 山西 汾陽　032200；4. 山西體育職業學院， 山西 太原　030006)

?

跑臺運動通過上調前額葉皮質BDNF表達改善慢性應激大鼠的抑郁行為

崔建梅1，藥宏慧2，于芳1，薄媛媛1，蘇曉云3，龐立杰4

(1．中北大學 體育學院， 山西 太原030051；2．太原學院 體育系， 山西 太原030051；3. 山西醫科大學 汾陽學院， 山西 汾陽032200；4. 山西體育職業學院， 山西 太原030006)

摘要：目的：通過跑臺運動對慢性不可預知應激大鼠抑郁樣行為及前額葉皮質腦源性神經營養因子(BDNF)的含量變化，旨在探討跑臺運動治療抑郁癥的作用靶點及作用機制。方法：健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機分為正常對照組(C，n=10)、應激模型組(CUMS，n=10)及應激運動組(CUMS+E，n=10)3組，通過慢性不可預知應激建立大鼠抑郁模型。CUMS+E組大鼠采取4周跑臺運動，通過曠場得分實驗及明暗箱探索實驗觀察跑臺運動對應激大鼠抑郁樣行為學的影響；行為學測試結束后取前額葉皮質用免疫組織化學法測定BDNF表達量。結果：1)CUMS組大鼠曠場實驗中央格時間百分比、中央格次數及總運動能力(跨格+直立次數)比正常對照組大鼠均顯著下降(P<0.01，P<0.01，P<0.01)；明暗箱探索實驗中，CUMS組大鼠明暗箱穿梭次數及明箱停留時間均顯著減少(P<0.01，P<0.01)；CUMS大鼠與正常對照組比較，前額葉皮質BDNF數量及面積均顯著下降(P<0.01，P<0.01)；2)4周跑臺運動顯著改善了慢性應激大鼠的抑郁樣行為，增強了慢性應激大鼠海馬BDNF的表達。結論：當前研究發現4周中等強度跑臺運動可以通過激活前額葉皮質BDNF通路，增強前額葉皮質BDNF的表達改善慢性應激大鼠的抑郁行為，證實了體育鍛煉可以作為治療和預防抑郁癥的重要手段。

關鍵詞：跑臺運動；抑郁樣行為；前額葉皮質；腦源性神經營養因子

抑郁癥是一種使人衰弱的、常見的威脅人們生活的精神障礙性疾病，全球范圍內患病率大約為17%。人們普遍認為壓力，特別是慢性壓力與抑郁癥的發展密切相關，慢性不可預知應激(CUMS，chronic unpredictable mild stress)近年來被認為是抑郁癥有效和可靠的動物模型。事實上，CUMS可以導致動物表現出類似人類抑郁癥患者的癥狀，運動能力及探索能力下降，絕望無助及快感缺乏，可以引發與臨床抑郁癥相似的行為及生理變化[1]。而且，CUMS可以通過動物行為及生物學指標的變化用于評估抗抑郁藥的病理生理機制及作用機制的研究。流行病學調查表明：應激壓力與抑郁癥的發生、復發及惡化有關[2]。

前額葉皮質(prefrontal cortex，PFC)為位于額葉前部的新皮質與情緒控制和動機形成存在密切關系。研究認為，PFC可能在慢性應激導致的抑郁樣行為中發揮重要作用。通過對抑郁癥病人斷層掃描及磁共振成像發現前額葉皮質容量減少，且對情緒障礙患者的大腦尸檢發現抑郁病人前額葉皮質神經角質細胞減少[3]。Ongür等研究認為前額葉皮質與控制情緒行為和應激反應的大腦區域如杏仁核、下丘腦、中腦導水管周圍灰質等連接緊密[4]。腦源性神經營養因子(BDNF)是一種分泌蛋白，作用于神經系統的特定神經元，參與神經元的生存，并激活新的神經元和突觸的生長和分化。通過臨床及動物實驗證實，BDNF與抑郁樣行為有關，并且參與調節HPA軸的活性，已經被視為抗抑郁藥的作用靶點[5]，但是通過BDNF通路治療抑郁癥的機制還不清楚。

大量的研究表明，體育鍛煉對應激壓力系統失調引起的情緒和認知障礙可能具有保護性作用[6]。臨床報告認為，常規的體育鍛煉比抗抑郁藥物更能阻止抑郁病人抑郁癥的復發，因此Trivedi等認為體育鍛煉可以作為改善抑郁癥狀首選的治療方法之一[7]。此外，本課題組先前對動物的研究已經表明，運動鍛煉可以改善抑郁大鼠的抑郁樣行為[8]。然而跑臺鍛煉是否可以通過提高前額葉皮質BDNF的水平改善抑郁大鼠的抑郁樣行為尚不清楚。因此，本研究通過復制大鼠CUMS應激模型，探討跑臺運動改善CUMS大鼠抑郁樣行為是否與前額葉皮質BDNF的水平增高有關。

1材料與方法

1.1動物及分組

30只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供(重200～220 g)，在中北大學動物飼養室進行飼養，整個實驗過程中除應激程序中水及食物的剝奪外，實驗動物均自由攝食和飲水，室溫(22±2)℃，濕度(55±10)%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗(光照8:00-20:00，黑除20:00-8:00；除了應激程序的晝夜顛倒)。30只大鼠適應實驗室環境一周后，隨機分為3組：即正常對照組(C，n=10)、應激模型組(CUMS，n=10)及應激運動組(CUMS+E，n=10)，CUMS組及CUMS+E 組大鼠單籠飼養。

1.2CUMS模型制備

根據Braun等[9]描述的慢性應激程序稍作修改制備大鼠CUMS應激程序，CUMS及CUMS+E組大鼠接受7種不同的應激刺激(見表1)，大鼠每天接受一種應激，同種刺激不連續出現，每周應激程序隨機安排，連續4周。C組除了常規的鼠籠清潔不做任何干擾。

1.3跑臺訓練安排

CUMS及CUMS+E組大鼠從第二周開始每天上午接受為期4周的慢性不可預知的溫和應激，同時CUMS+E組大鼠進行跑臺鍛煉，大鼠0坡度跑臺運動4周(見表2)。為了鼓勵大鼠完成跑臺運動及對大鼠造成不必要的刺激，跑臺訓練時不能對大鼠使用電擊裝置驅趕。

表2　CUMS+E組大鼠跑臺運動強度安排

1.4行為學測試

慢性應激及跑臺鍛煉結束后第二天下午9:00-15:00，按以前學者的操作方法進行開場試驗及明暗箱探索試驗。

1.4.1曠場實驗[10](Open field test，OFT)

大鼠稱重后被放在曠場實驗箱(100 cm×100 cm×50 cm)的中央讓大鼠自由探索5 min，上方的攝像頭記錄大鼠實驗箱內的行為學指標，中央格時間百分比、中央格進入次數、總運動能力(跨格+直立次數)，清洗實驗箱后進行下一只大鼠的測試。

1.4.2明暗箱探索實驗(Light dark，LD)

LD 試驗是評估大鼠焦慮行為的經典實驗，是基于大鼠討厭光亮喜歡黑暗的習性而建立的。本實驗明暗箱為一個分為明箱(白色敞開箱：76 cm×21 cm×31 cm)和暗箱(黑色封閉箱76 cm×21 cm×31 cm)的自制木箱。明暗箱之間有一可以在明箱和暗箱內穿梭的小洞(8 cm×8 cm)。實驗開始時，將大鼠放入明箱，10 s后將明暗箱之間的門打開，測量大鼠5 min內明暗箱穿梭次數及明箱停留時間比(明箱中的時間占總測試時間的百分比%)。

1.5前額葉皮質取材及免疫組化染色

行為測試結束后，根據前期學者描述的方法，大鼠經戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，醫用剪刀開胸，行左心室心尖穿刺后剪破右心耳，從主動脈快速灌入300 ml冷生理鹽水，隨后灌入150 ml含4%多聚甲醛的PBS磷酸鹽緩沖液。灌注結束后迅速剝離腦組織，將腦組織置于上述溶液中后固定24 h，70%、90%及96% 酒精梯度脫水，石蠟包埋后行腦組織冠狀切片(厚5 μm)。為消除內源性過氧化物酶的活性，切片入3%甲醇H2O2液室溫孵育30 min，滴加一抗兔抗BDNF(1:500，100 ul)，4℃ 孵育24 h，用PBS液沖洗3次(每次5 min)，加入二抗(生物素標記的山羊抗兔)，室溫孵育30 min；PBS液沖洗3次后入ABC液室溫下進行DAB顯色，蘇木素復染2～3 min，最后脫水、透明、封片。

1.6前額葉皮質BDNF圖像分析

用Olympus BX50型顯微鏡組合攝像，形態學圖像分析系統對大鼠前額葉皮質BDNF表達進行圖像分析。每組隨機測試10張切片，分別測量前額葉皮質400倍BDNF的表達(陽性細胞數及面積)。

1.7統計學分析

數據結果組間差異比較采用單因素方差分析(SPSS18.0)，數據結果表示為平均值±標準差(SD)。數據統計以P<0.05表示組間差異具有統計學意義。

2結果

2.1跑臺運動對慢性應激大鼠曠場試驗行為指標的影響

曠場實驗用來評估動物的抑郁樣行為，通常嚙齒動物會花更多時間探索曠場試驗的中心區域。本研究中曠場實驗結果顯示(見表3)，CUMS組大鼠5分鐘的曠場探索實驗中僅僅19.34%的時間在中央區域，而正常對照組及CUMS+E組大鼠在中央格的時間分別為35.34%及23.56%；且與而正常對照組比較，CUMS組大鼠中央格次數及總運動能力均顯著下降(P<0.01，P<0.01)，而經過4周跑臺運動，與CUMS組大鼠比較，CUMS+E組大鼠中央格次數及(跨格+直立)次數均顯著增加(P<0.05，P<0.01)。

表3　跑臺運動對CUMS大鼠曠場實驗行為指標的影響±s)

注：##P<0.01，#P<0.05，與C組比較；△△P<0.01，△P<0.05，與CUMS組比較

2.2跑臺運動對慢性應激大鼠明暗箱探索實驗行為指標的影響

在明暗箱測試中，如果大鼠花更多的時間在暗箱提示大鼠高焦慮行為，本實驗結果顯示(見表4)，5分鐘明暗箱探索實驗中CUMS組大鼠18.33%的時間在明箱，而正常對照組及CUMS+E組大鼠明箱時間百分比分別為32.54%及27.86%；與正常組大鼠比較，CUMS組大鼠明暗箱穿梭次數及明箱的時間百分比均顯著下降(P<0.01，P<0.01)，下降幅度為43.66%及42.68%，而跑臺運動可顯著改善應激大鼠的明暗箱探索行為，與CUMS組大鼠比較，CUMS+E組大鼠明暗箱探索次數及明箱時間百分比均顯著增加(P<0.01，P<0.05)，增加幅度為45.77%及51.99%，提示規律性的跑臺運動可以使慢性應激大鼠對明亮環境的探索性增加。

組別n明箱時間百分比(%)明暗箱穿梭次數C1032.54±10.6918.98±7.34CUMS1018.33±3.98##10.88±2.49##CUMS+E1027.86±7.68△15.86±5.87##△△

注：##P<0.01，#P<0.05，與C組比較；△△P<0.01，△P<0.05，與CUMS組比較

2.3跑臺運動對慢性應激大鼠前額葉皮質BDNF表達的影響

與正常對照組比較(見表5)，慢性不可預知應激減少了前額葉皮質BDNF的表達，數量及面積均顯著下降(P<0.01，P<0.01)，下降幅度分別為45.66%及59.59%(tab4，Fig2A-B)；然而，4周跑臺運動顯著的糾正了慢性應激引起的前額葉皮質BDNF的下降，數量及面積均顯著增加(P<0.05，P<0.05)，增加幅度分別為45.66%及32.85%(tab4，Fig2B-C)。

表5　跑臺運動對前額葉皮質BDNF表達的影響±s)

注：##P<0.01，#P<0.05，與C組比較；△△P<0.01，△P<0.05，與CUMS組比較

圖1A　PFC冠狀定位圖1B　PFC區BDNF陽性神經元分布

圖2A-C　前額葉皮質BDNF表達注：通過圖1A-C可知，4周跑臺運動可以糾正由慢性應激引起的BDNF表達減少。

3討論

本研究結果顯示慢性不可預知應激導致了大鼠抑郁樣行為，行為學結果顯示，曠場探索實驗中應激大鼠中央格時間百分比及中央格次數、總運動能力(跨格次數+直立次數)均顯著下降，明暗箱探索實驗中，明箱時間百分比及明暗箱穿梭次數顯著下降。行為學結果與以往學者研究結果一致[11]，提示本實驗大鼠慢性不可預知溫和應激致抑郁模型建立成功。研究認為，規律的有氧運動可以對身心健康及健身產生有益的作用，且Blumenthal等認為體育鍛煉可以有效降低應激損傷和改善抑郁病人的抑郁情緒[12]。目前的研究表明，慢性應激大鼠經過4周跑臺運動可以改善慢性應激大鼠的抑郁樣行為包括曠場實驗中大鼠的運動能力及明暗箱實驗中大鼠對新環境的探索能力增強，提示跑臺運動具有一定的抗抑郁作用。

前額葉皮層是將情感信息轉化為應激壓力的重要區域之一，此區域神經元結構及其連接的變化或許構成了精神障礙的病因[13]。腦源性神經營養因子BDNF是調節神經元的形成、可塑性及控制情緒的大腦回路完整性的關鍵分子，在應激因子導致的神經形成減少及行為缺陷方面包括抑郁癥發病中發揮重要作用。大量的臨床研究表明，抑郁癥患者表現出較低的BDNF水平，然而抗抑郁藥物可以使BDNF恢復到正常水平[14]。此外，在許多抑郁癥的動物模型如強迫游泳、束縛應激均引起大鼠大腦BDNF表達水平顯著下降[15]。當前研究結果顯示，28天慢性不可預知的應激引起前額葉皮質BDNF表達減少，提示前額葉皮質BDNF在慢性應激致抑郁樣行為中可能發揮了重要作用。大鼠海馬注入BDNF可以產生抗抑郁的效果[16]，且動物及臨床試驗證實，許多抗抑郁藥都是通過調節大腦BDNF的表達發揮抗抑郁的作用[17]。因此，可以推測CUMS大鼠曠場實驗中中央格時間百分比及總運動能力(跨格+直立次數)顯著減少，明暗箱探索實驗中明箱時間百分比及穿梭次數下降等抑郁行為與前額葉皮質BDNF的表達減弱有關，BDNF水平的減少意味著前額葉皮質神經元缺乏營養，進一步損傷神經元的功能，導致抑郁癥的發生。最近的研究表明，運動可以被認為是抑郁癥的首選治療方式，Liu等通過曠場實驗、糖水偏愛及強迫游泳實驗發現，4周每周5天的游泳運動改善了慢性應激大鼠的抑郁行為[18]。本研究設計的CUMS大鼠跑臺運動4周可以改善慢性應激大鼠的抑郁樣行為，且實驗結果顯示慢性應激使前額葉皮質BDNF 表達減少，而跑臺運動可以恢復應激引起的前額葉皮質BDNF的下降。研究認為，應激可能會引起腎上腺皮質(HPA)軸失調，糖皮質激素過量分泌與抑郁癥有關，本課題組前期研究已證實[19]。糖皮質激素受體一直被認為是腦源性神經營養因子BDNF表達的重要調節因子[20]，Yi等研究證實大腦重復注入皮質醇可以減少大腦BDNF的表達[21]，此外，抗抑郁藥物可以通過減少糖皮質激素受體增加海馬腦源性神經營養因子誘導海馬神經生成。因此，我們推測，跑臺運動通過降低血清皮質酮水平，提高前額葉皮質腦源性神經營養因子BDNF的表達從而增強前額葉皮質神經元的營養，改善慢性應激大鼠的抑郁行為，具體機制需進一步研究。

結論：當前研究發現4周中等強度跑臺運動可以通過激活前額葉皮質BDNF通路，增強前額葉皮質BDNF的表達，增強前額葉皮質神經元的營養從而改善慢性應激大鼠的抑郁樣行為。因此，我們的研究結果提供了跑臺運動改善抑郁行為的分子機制，此外證實了體育鍛煉可以作為治療和預防抑郁癥的重要手段。

參考文獻：

[1] Liu D, Xie K, Yang X,etal. Resveratrol reverses the effects of chronic unpredictable mild stress on behavior, serum corticosterone levels and BDNFexpression in rats[J]. Behav Brain Res, 2014, 264:9-16.

[2] Willner P. Chronic mild stress (CMS) revisited: consistency and behavioural neurobiological concordance in the e?ects of CMS[J]. Neuropsychobiology, 2005,52:90-110.

[3] J Savitz, WC Drevets. Bipolar and major depressive disorder: neuroimaging the developm- ental degenerative divide[J]. Neurosci Biobehav Rev, 2009,33:699-771.

[4] D Ongür, JL Price. The organization of networks within the orbital and medial prefrontal cortex of rats, monkeys and humans[J]. Cereb Cortex, 2000,10:206-219.

[5] P Gormanns, NS Mueller, C Ditzen,etal.Phenome-transcriptome correlation unravels anxiety and depression related pathways[J]. J Psychiatr Res,2011,45:973-979.

[6] Blumenthal JA, Babyak, MA, Doraiswamy PM, et al. Exercise and pharmacotherapy in the treatment of major depressive disorder[J]. Psychosom. Med,2007,69:587-596.

[7] Trivedi MH, Greer TL, Grannemann BD,etal.TREAD: TReatment with Exercise augmentation for Depression: study rationale and design[J]. Clinical Trials, 2006;3:291-305.

[8]崔建梅,蘇曉云,王聽,等.自愿轉輪運動對抑郁模型大鼠行為學、腦組織神經Y肽及中央杏仁核一氧化氮合酶表達的影響[J].體育科學,2014,34(5):15-22.

[9] Braun AA, Skelton MR, Vorhees CV,etal.Comparison of the elevated plus and elevated zero mazes in treated and untreated male Sprague-Dawley rats: effects of anxiolytic and anxiogenic agents[J]. Pharmacol Biochem Behav,2011,97(3):406-415.

[10] Zheng H, Liu Y, Li W,etal.Beneficial effects of exercise and its molecular mechanisms on depression in rats[J]. Behavioural Brain Res, 2006,168:47-55．

[11] Li Cai, Rong Li, WJ Tang,etal.Antidepressant-like effect of geniposide on chronic unpredictable mild stress-induced depressive rats by regulating the hypothalamus -pituitary -adrenal axis[J]. European Neuropsychopharmacology, 2015, 25(8):1332 -1341.

[12] Blumenthal, JA, Babyak MA, Doraiswamy, PM,etal.Exercise and pharmacotherapy in the treatment of major depressive disorder[J]. Psychosom Med, 2007,69:587-596.

[13] Esther Castillo-Gómeza, Simona Covielloa, Marta Perez-Rando,etal.Streptozotocin diabetic mice display depressive-like behavior and alterations in the structure, neurotransmission and plasticity of medial prefrontal cortex interneurons[J]. Brain Research Bulletin,2015,116: 45 -56.

[14] JD Shen, LG Ma, CY Hu,etal.Berberine up-regulates the BDNF expression in hippocampus and attenuates corticosterone -induced depressive-like behavior in mice[J]. Neuroscience Letters, 2016, 614:77-82.

[15] LT Yi, J Li, Q Liu,etal.Antidepressant-like effect of oleanolic acid in mice exposed to the repeated forced swimming test[J]. J. Psychopharmacol.,2013,27:459-468.

[16] YY Ye, GH Wang, HL Wang,etal.Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) infusion restored astrocytic plasticity in the hippocampus of a rat model of depression[J]. Neuroscience Letters,2011,503(1):15-19.

[17] RS Duman, LM Monteggia. A neurotrophic model for stress-related mood disorders[J]. Biol Psychiatry, 2006,59:1116-1127.

[18] WN Liu, Hui Sheng, YJ Xu,etal.Swimming exercise ameliorates depression-like behavior in chronically stressed rats: Relevant to proinflammatory cytokines and IDO activation[J]. Behavioural Brain Research, 2013,242:110-116.

[19]于芳,崔建梅,薄媛媛,等.跑臺運動對慢性應激抑郁大鼠行為學及海馬CAl、CA3區NGF表達的影響[J].首都體育學院學報, 2015,27(2):185-191.

[20] T Numakawa, S Suzuki, E Kumamaru,etal.BDNF function and intracellular signaling in neurons[J]. Histol. Histopathol, 2010,25:237-258.

[21] LT Yi, J Li, HC Li,etal.Ethanol extracts from Hemerocallis citrina attenuate the decreases of brain-derived neurotrophic factor, TrkB levels in rat induced by corticosterone administration[J].J Ethnopharmacol, 2012,144:328-334.

Treadmill exercise ameliorates depression-like behavior by increasing prefrontal cortex BDNF expression in chronic stress rats

CUI Jian-mei1, YAO Hong-hui2, YU Fang1, BO Yuan-yuan1, SU Xiao-yun3, PANG Li-jie4

(1.SchoolofP.E.,NorthUniversityofChina,Taiyuan030051,Shanxi,China; 2.Dept.ofP.E.,TaiyuanCollege,Taiyuan030051,Shanxi,China; 3.FenyangSchool,ShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,Shanxi,China; 4.ShanxiVocationalSportsCollege,Taiyuan030006,Shanxi,China)

Abstract:Objective:To observe the changes of the depressive behavior and prefrontal cortex BDNF (brain derived neurotrophic factor) expression in CUMS (chronic unpredictable mild stress) rats and explore the possible mechanism and targets of treadmill exercise treatment depression.Methods:30 adult SD (Sprague-Dawley) male rats were randomly assigned into 3 groups: control group (C), chronic unpredictable stress group rats (CUMS) and stress exercise group (CUMS+E). All the rats were subjected to CUMS except the control group. The behavior changes were observed by open-field test (OFT) and Light dark test (LD) after CUMS+E group rats received 4-week treadmill exercise; subsequently, immunohistochemical staining detect BDNF expression in prefrontal cortex (PFC). Results:1) In the OFT test, central numbers, (crossing squares + rearing numbers) and the percent of the staying central cell time significantly decreased (P<0.01, P<0.01, P<0.01); in LD test, transitions between two area and light box time decreased (P<0.01, P<0.01) in CUMS group rats when compared to the control group; compared with the CUMS group rats, BDNF expression enhanced in rat PFC of CUMS+E group rats. 2) Exercise ameliorated depression-like behavior, increased Prefrontal Cortex BDNF expression in CUMS+E rats.Conclusion:the present observations verified that 4-week treadmill exercise reverses stress-induced depressive-like behavior via an increase in BDNF signaling and may increase BDNF expression in Prefrontal Cortex. The present findings intensively confirmed the antidepressant-like effects of treadmill exercise and supported the exercise as an important means to treat human depression.

Key words:treadmill exercise; depressive-like behavior; prefrontal cortex; BDN

中圖分類號：G804.7

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9840(2016)01-0049-05

通訊作者：于芳(1968-)，女，河北人，教授,研究方向運動與中醫康復。

作者簡介：崔建梅(1972-)，女，河北人，講師，碩士，研究方向運動與中醫康復。

基金項目：國家自然基金(編號：30671019)；山西省自然科學基金(編號：2014011041-6)。

收稿日期：2016-01-08