葡萄多酚對糖尿病大鼠膀胱功能的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

高兆允，陳守臻，史本康(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院沂南分院，山東沂南76300；山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

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葡萄多酚對糖尿病大鼠膀胱功能的保護(hù)作用及其機(jī)制探討

高兆允1，陳守臻2，史本康2(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院沂南分院，山東沂南276300；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

摘要：目的探討葡萄多酚(GSPE)對糖尿病大鼠膀胱功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、DM組、GSPE組各10只。DM組、GSPE組腹腔注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型，對照組腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液。造模成功后，GSPE組按250 mg/(kg·d)GSPE灌胃1次/d，對照組、DM組以等量生理鹽水灌胃，均持續(xù)8周。采用尿流動力學(xué)方法，在膀胱容積不變的條件下測定各組膀胱逼尿肌的最大收縮壓力及靜息壓力。處死各組大鼠后取膀胱組織，行HE染色觀察膀胱病理組織學(xué)表現(xiàn)，采用分光光度法檢測膀胱組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)包括丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平。結(jié)果DM組、GSPE組膀胱逼尿肌最大收縮壓力均低于對照組(P均<0.01)，GSPE組膀胱逼尿肌最大收縮壓力高于DM組(P<0.01)。與對照組相比，DM組膀胱組織變薄、逼尿肌排列紊亂、炎細(xì)胞浸潤增加，而GSPE組膀胱組織較DM組增厚，逼尿肌肌肉組織排列整齊且炎細(xì)胞浸潤減少。DM組膀胱組織MDA水平高于對照組，SOD、GSH-Px表達(dá)水平均低于對照組(P均<0.01)。GSPE組膀胱組織MDA表達(dá)水平低于DM組，SOD、GSH-Px表達(dá)水平均高于DM組(P<0.01或0.05)。結(jié)論GSPE對糖尿病大鼠膀胱功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低膀胱組織的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病;膀胱功能障礙；葡萄多酚；氧化應(yīng)激

膀胱功能障礙是糖尿病患者的常見并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為膀胱過度活動如尿急、尿潴留、膀胱感覺功能減退等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激損傷在糖尿病膀胱功能障礙的發(fā)病中具有重要作用[2]。葡萄多酚(GSPE)是從葡萄皮和葡萄籽中提取的混合物，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，在心血管疾病、腎病等的治療中具有較好的器官保護(hù)作用[3,4]。目前，GSPE對糖尿病患者的膀胱功能是否具有保護(hù)作用尚未見報道。2014年6月～2015年6月，我們對糖尿病大鼠給予GSPE灌胃，觀察GSPE對糖尿病大鼠膀胱功能及膀胱組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討GSPE對糖尿病大鼠膀胱功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物與試劑健康雌性Wistar大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量250 g左右，購于山東大學(xué)實(shí)驗動物中心(合格證號SCXX20090011)。GSPE(純度>96%)購于天津建峰有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma-Aldrich公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、BCA蛋白濃度試劑盒購于北京碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒SP-9000、DAB顯色試劑盒購于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2分組及模型制備將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、DM組、GSPE組各10只。DM組、GSPE組制備糖尿病模型，大鼠禁食18 h后，按65 mg/kg的劑量腹腔注射STZ，72 h后尾靜脈采血檢測血糖水平，以血糖水平>300 mg/dL為糖尿病模型制備成功。對照組腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉緩沖液。

1.3干預(yù)方法造模成功后，GSPE組按250 mg/(kg·d)劑量灌胃GSPE 1次/d，對照組、DM組予等量生理鹽水灌胃處理，均持續(xù)8周。

1.4膀胱內(nèi)壓力測定干預(yù)8周后，采用尿流動力學(xué)方法，在膀胱容積不變的條件下測定各組膀胱內(nèi)壓力。麻醉成功后，取下腹正中切口，暴露膀胱，PE-50管插入膀胱頂部，并與三通管連接，一端注入生理鹽水，一端測定膀胱壓力，一端進(jìn)入膀胱。然后以0.075 mL/min的速度向膀胱內(nèi)灌注生理鹽水，直至觀察到出現(xiàn)膀胱等容性收縮。穩(wěn)定0.5 h后，測定膀胱內(nèi)壓力，包括膀胱逼尿肌的最大收縮壓力及靜息壓力。

1.5膀胱組織病理學(xué)觀察測定膀胱內(nèi)壓力后，將各組大鼠以頸椎脫臼法處死，取出膀胱組織，在4%甲醛溶液中固定后，制作4 μm石蠟切片。脫蠟后行HE染色，顯微鏡下觀察各組膀胱組織病理改變。

1.6膀胱組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)測定采用分光光度法檢測各組膀胱組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)包括MDA、SOD、GSH-Px表達(dá)水平。MDA測定基于MDA和硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，在530 nm處測定吸光度。SOD測定基于黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)，在450 nm處測定吸光度。GSH-Px測定通過檢測NADPH的減少量計算活力水平，在340 nm處測定吸光度。

2結(jié)果

2.1各組膀胱內(nèi)壓力比較DM組、GSPE組膀胱逼尿肌最大收縮壓力均低于對照組(P均<0.01)，GSPE組膀胱逼尿肌最大收縮壓力高于DM組(P<0.01)。各組靜息壓力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　　　　各組膀胱逼尿肌最大收縮壓力及靜息

注：與對照組比較，*P<0.01；與DM組比較，﹟P<0.01。

2.2各組膀胱病理組織學(xué)表現(xiàn)與對照組相比，DM組膀胱組織變薄，逼尿肌排列紊亂，炎細(xì)胞浸潤增加。GSPE組膀胱組織較DM組增厚，逼尿肌肌肉組織排列整齊且炎細(xì)胞浸潤減少。

2.3各組膀胱組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較DM組膀胱組織MDA水平高于對照組，SOD、GSH-Px水平均低于對照組(P均<0.01)。GSPE組膀胱組織MDA水平低于DM組，SOD、GSH-Px水平均高于DM組(P<0.01或0.05)。見表2。

表2　各組膀胱組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較±s)

注： 與對照組比較，*P<0.01；與DM組比較，﹟P<0.05，△P<0.01。

3討論

糖尿病膀胱功能障礙又稱為糖尿病膀胱病，是常見的糖尿病并發(fā)癥[5]。糖尿病膀胱功能障礙的發(fā)病機(jī)制是多方面的，與膀胱肌源性和神經(jīng)源性的改變密切相關(guān)，最終可導(dǎo)致逼尿肌細(xì)胞和神經(jīng)支配的損傷，造成逼尿肌收縮無力、膀胱內(nèi)壓降低，發(fā)生排尿功能障礙[6～10]。研究證實(shí)，高糖是導(dǎo)致糖尿病多種并發(fā)癥的重要因素，其造成的氧化應(yīng)激損傷在糖尿病膀胱功能障礙發(fā)病中也發(fā)揮重要作用。糖尿病誘導(dǎo)的膀胱逼尿肌肌力下降與高水平脂類過氧化產(chǎn)物、醛糖還原酶的過表達(dá)及多元醇通路的激活密切相關(guān)，而這些改變均反映了機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷[11]。氧化應(yīng)激損傷還可以誘導(dǎo)膀胱逼尿肌凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病膀胱功能障礙[12]。此外，氧化應(yīng)激損傷也可能通過干擾神經(jīng)生長因子的表達(dá)造成神經(jīng)退行性變，導(dǎo)致膀胱神經(jīng)源性損傷[13]。

GSPE又稱葡萄子原花青素，是從葡萄子中提取的一種天然多酚類化合物。研究證實(shí)，GSPE在生物學(xué)、藥理學(xué)、治療學(xué)和化學(xué)方面對氧自由基和氧化應(yīng)激均具有顯著的拮抗作用[3,4]。研究發(fā)現(xiàn)，與維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素相比，GPES可以對氧自由基及其所引起的脂質(zhì)過氧化、DNA損傷等氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮更顯著的保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，DM組膀胱逼尿肌最大收縮壓力降低，病理表現(xiàn)為膀胱組織變薄、逼尿肌排列紊亂、炎細(xì)胞浸潤增加，提示糖尿病可造成逼尿肌病理損害，降低膀胱逼尿肌最大收縮壓力，造成糖尿病膀胱功能障礙；GSPE組膀胱逼尿肌最大收縮壓力高于DM組，膀胱組織較DM組增厚，逼尿肌肌肉組織排列整齊并且炎細(xì)胞浸潤減少，提示GSPE減輕了糖尿病大鼠膀胱的病理損傷，使膀胱組織收縮功能提高，對糖尿病大鼠膀胱功能具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是機(jī)體中氧化劑的一種相對過負(fù)荷，是由自由基產(chǎn)生增多或抗氧化系統(tǒng)功能降低引起的。隨著血糖的升高，在高血糖的刺激下，糖尿病患者體內(nèi)自由基大量生成，產(chǎn)生了糖尿病氧化應(yīng)激損傷。增多的自由基能在膜磷脂上產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，導(dǎo)致各種毒素的生成，如MDA。抗氧化清除酶如SOD、GSH-Px等是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的主要成分，具有保護(hù)細(xì)胞和組織、防止氧化損傷的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，DM組膀胱組織MDA水平高于對照組，SOD、GSH-Px水平均低于對照組，提示糖尿病大鼠膀胱組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)失衡，出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷；GSPE組膀胱組織MDA水平低于DM組，SOD、GSH-Px水平均高于DM組，提示GSPE可顯著恢復(fù)GSH-Px及SOD的活性，降低MDA的水平，發(fā)揮抗氧化作用，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，可能是GSPE減輕糖尿病膀胱功能障礙的機(jī)制之一。

綜上所述，GSPE對糖尿病大鼠膀胱功能具有保護(hù)作用，可能與其降低膀胱組織中氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kirschner HR, Daneshgari F, Vahabi B, et al. Does diabetes mellitus-induced bladder remodeling affect lower urinary tract function [J]. Neurourol Urodyn, 2012,31(3):359-364.

[2] Roberts CK, Sindhu KK. Oxidative stress and metabolic syndrome[J]. Life Sci, 2009,84 (21-22):705-712.

[3] Asha DS, Sagar CB, Manjula KR, et al. Grape seed proanthocyanidin lowers brain oxidative stress in adult and middle-aged rats[J]. Exp Gerontol, 2011,46(11):958-964.

[4] Yu F, Li BY, Li XL, et al. Proteomic analysis of aorta and protective effects of grape seed procyanidin B2 in db/db mice reveal a critical role of milk fat globule epidermal growth factor-8 in diabetic arterial damage[J]. PLoS One, 2012,7(12):52541.

[5] Arrellano VF, Urrutia OM, Arroyo C, et al. A comprehensive review of urologic complications in patients with diabetes[J]. Springerplus, 2014,23(3):549.

[6] Liu G, Daneshgari F. Diabetic bladder dysfunction[J]. Chin Med J (Engl), 2014,127(7):1357-1364.

[7] Daneshgari F, Liu G, Birder L, et al. Diabetic bladder dysfunction: current translational knowledge[J]. J Urol, 2009,182(6):18-26.

[8] Li Y, Shi B, Wang D, et al. Nerve growth factor and substance P: expression in a rat model of diabetic bladder[J]. Int Urol Nephrol, 2011,43(1):109-116.

[9] Langdale CL, Thor KB, Marson L, et al. Maintenance of bladder innervation in diabetes: a stereological study of streptozotocin-treated female rats[J]. Auton Neurosci, 2014,185(10):59-66.

[10] Ren LM, Zhuo YJ, Hao ZS, et al. Berberine improves neurogenic contractile response of bladder detrusor muscle in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. J Ethnopharmacol, 2013,150(3):1128-1136.

[11] Changolkar AK, Hypolite JA, Disanto M, et al. Diabetes induced decrease in detrusor smooth muscle force is associated with oxidative stress and overactivity of aldose reductase[J]. J Urol, 2005,173(1):309-313.

[12] Ha US, Bae WJ, Kim SJ, et al. Protective effect of cyaniding-3-O-beta-D-glucopyranoside fraction from mulberry fruit pigment against oxidative damage in streptozotocin-induced diabetic rat bladder [J]. Neurourol Urodyn, 2013,32(5):493-499.

[13] Ochodnicky P, Cruz CD, Yoshimura N, et al. Nerve growth factor in bladder dysfunction: contributing factor, biomarker, and therapeutic target[J]. Neurourol Urodyn, 2011,30(7):1227-1241.

[14] Ding Y, Dai X, Jiang Y, et al. Grape seed proanthocyanidin extracts alleviate oxidative stress and ER stress in skeletal muscle of low-dose streptozotocin and high-carbohydrate/high-fat diet-induced diabetic rats[J]. Mol Nutr Food Res, 2013,57(2):365-369.

[15] Bonnefont RD, Bastard JP, Jaudon MC, et al. Consequences of the diabetic status on the oxidant/antioxidant balance[J]. Diabetes Metab, 2000,26(3):163-176.

Protective effect of grape-seed proanthocyanidin extract on bladder function of rats with diabetes mellitus

GAOZhaoyun1,CHENShouzhen,SHIBenkang

(1YinanBranchofQiluHospitalofShandongUniversity,Yinan276300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of grape-seed proanthocyanidin extract (GSPE) on bladder function of rats with diabetes mellitus (DM).MethodsThirty female Wistar rats was randomly divided into 3 groups: control group, DM group and GSPE group, and each group consisted of 10 rats. Intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) was used to construct the model of diabetes in DM group and GSPE group. The same dose of sodium citrate buffer was used in the control group. Rats in the GSPE group were given 250 mg/kg of GSPE by oral gavage once a day for 8 weeks. The control group and DM group were treated with the same amount of normal saline. Urodynamic method was used to examine the bladder pressure of the rats. The bladder histopathological changes were observed by HE staining. The quantity of MDA and the activities of superoxide dismutase (SOD) and GSH-Px was examined by spectrophotometry. ResultsCompared with the control group, the bladder contraction pressure in the DM group and GSPE group was decreased (P<0.01). However, the bladder contraction pressure in the GSPE group was higher than that in the DM group (P<0.01). According to HE staining, the bladder tissue became thin, the detrusor was disordered and the infiltrating inflammatory cells were increased in the DM group as compared with those of the control group. The bladder tissue became thick and the infiltrating inflammatory cells were decreased in the GSPE group as compared with those of the DM group. Compared with the DM group, the level of MDA was lower and the levels of SOD and GSH-Px were higher in the GSPE group (P<0.01 or P<0.05). ConclusionGSPE has protective effect on diabetic bladder dysfunction, and its mechanism may be associated with the increased oxidative stress injury of the bladder tissues.

Key words:diabetes mellitus; bladder dysfunction; grape-seed proanthocyanidin extract; oxidative stress

(收稿日期：2015-11-15)

中圖分類號：R694.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0004-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.002

通信作者簡介：史本康(1965-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向為泌尿外科疾病的診斷及治療。E-mail： bkshi68@163.com

第一作者簡介：高兆允(1970-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向為泌尿外科疾病的診斷及治療。E-mail： yngaozhaoyun@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81470987)。