miRNA-455在小鼠心室重構中的作用及機制探討

吳春濤，李擁軍(河北醫科大學第三醫院，石家莊05007；河北醫科大學第二醫院)

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miRNA-455在小鼠心室重構中的作用及機制探討

吳春濤1，李擁軍2(1河北醫科大學第三醫院，石家莊050017；2河北醫科大學第二醫院)

摘要：目的探討microRNAs-455(miR-455)在心室重構中的作用及其機制。方法 選擇小鼠18只，分為miR-455組、GFP組及假手術組各6只。miR-455組、GFP組均行升主動脈縮窄術，術后4周即進展為心室重構模型。假手術組術中僅游離主動脈弓但不結扎。miR-455組于術后第1、8、15、22天尾靜脈注射包被miR-455的腺病毒0.1 mL，GFP組及假手術組于同時點尾靜脈注射包被GFP的腺病毒0.1 mL。術后4周造模成功，應用心臟超聲檢查測量各組左心室舒張期內徑(LVIDd)、左心室舒張末容積(LVEDV)、左心室舒張期前壁厚度(LVAWd)、左心室射血分數(EF)。處死各組大鼠取心室肌行HE及Masson染色，觀察心肌病理改變。采用qRT-PCR法檢測各組心肌組織心肌肥厚基因[包括心房鈉尿因子(ANF)、骨骼肌肌動蛋白1(ACTA1)、β肌球蛋白重鏈]及心肌纖維化基因[包括轉化生長因子β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)]表達。采用Western blot法檢測各組心肌細胞中凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達。采用TUNEL染色法檢測各組心肌細胞凋亡情況，計算凋亡指數。結果與假手術組相比，GFP組LVIDd增加、LVEDV增加、LVAWd增厚、EF降低(P<0.01或0.05)；與GFP組相比，miR-455組LVIDd降低、LVEDV降低、LVAWd增厚、EF增加(P<0.01或0.05)。GFP組心肌組織呈心肌肥厚、心肌纖維化病理改變，miR-455組較GFP組心肌肥厚、心肌纖維化病理改變明顯減輕。GFP組各心肌肥厚基因及心肌纖維化基因mRNA表達均高于假手術組，miR-455組各心肌肥厚基因及心肌纖維化基因mRNA表達均低于GFP組(P<0.01或0.05)。與假手術組相比，GFP組Bax表達增加、Bcl-2表達降低、心肌細胞凋亡指數增高(P<0.01或0.05)；與GFP組相比，miR-455組Bax表達降低、Bcl-2表達增加、心肌細胞凋亡指數降低(P<0.01或0.05)。結論miR-455具有抑制心室重構、改善心功能的作用，可能與其抑制心肌肥厚、心肌纖維化、心肌細胞凋亡有關。

關鍵詞：miR-455；心室重構；心肌肥厚；心肌纖維化；細胞凋亡;小鼠

長期高血壓導致的心室重構是心臟不良事件的獨立危險因素，與心源性猝死、心律失常、心力衰竭等密切相關。心室重構可導致心肌肥厚、心肌凋亡、成纖維細胞增加、膠原纖維增生、心肌代謝異常及電生理改變等，是導致心力衰竭加重的重要原因。探討心室重構的機制，對于了解心力衰竭的發生發展具有重要意義。microRNAs(miRNAs)是一類具有轉錄后調節活性的小分子RNA，可通過轉錄后負性調節目的蛋白參與多種心血管疾病的發生。但miRNA-455(miR-455)與心室重構的關系尚不明確。2012年7月～2014年12月，我們通過升主動脈縮窄(TAC)術構建了心室重構小鼠模型，觀察轉染miR-455后心室重構小鼠心肌肥厚、心肌纖維化及心肌細胞凋亡的變化，探討miR-455在心室重構中的作用及其機制。

1材料與方法

1.1動物與材料雄性、健康昆明小鼠18只，4周齡，體質量(20±2)g，購自河北醫科大學。包被miR-455的腺病毒(5.0×109ifu/mL)和包被綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒(1.0×109ifu/mL)均購自Invitrogen公司。抗Bax和抗Bcl-2抗體購自博士德公司。GAPDH抗體購自Bio World公司。TUNEL試劑盒購自Roche公司。

1.2動物分組及心室重構模型制備將小鼠分為miR-455組、GFP組及假手術組各6只。miR-455組、GFP組均通過升主動脈縮窄術(TAC)制備心室重構模型，麻醉后于左胸骨邊緣約2 mm處沿第二肋間隙打開胸腔，游離主動脈弓，于鎖骨下動脈(第一分支)和左頸總動脈(第二分支)間穿0號線，然后平行于主動脈弓放置27-gauge(直徑0.4 mm)針頭，一同結扎后抽出針頭，使主動脈縮窄65%～70%。TAC術后4周即進展為心室重構，成為心室重構模型。假手術組手術同上，但術中僅游離主動脈弓而不結扎。

1.3干預方法miR-455組于TAC術后第1、8、15、22天尾靜脈注射包被miR-455的腺病毒0.1 mL。GFP組及假手術組于TAC術后第1、8、15、22天尾靜脈注射包被GFP的腺病毒0.1 mL。TAC術后4周，應用頸椎脫臼法處死小鼠，取心肌組織標本，行qRT-PCR法檢測心肌組織miR-455表達，miR-455組心肌組織miR-455表達高于GFP組，證實miR-455在小鼠體內轉染成功。

1.4心功能檢測于 TAC術后4周造模成功后，應用心臟超聲檢查評估各組心功能。氯胺酮麻醉，小鼠仰臥位，剪去心前區毛，應用超聲儀頻率為30 MHz的探頭在胸壁上行胸骨旁長軸、短軸、心尖和劍突切面超聲檢查，測量左心室舒張期內徑(LVIDd)、左心室舒張末容積(LVEDV)、左心室舒張期前壁厚度(LVAWd)、左心室射血分數(EF)。

1.5心肌組織病理改變觀察超聲檢查后應用頸椎脫臼法處死各組小鼠，迅速取出心臟，取心室肌，行HE及Masson染色，應用Motic 6.0分析軟件于顯微鏡下觀察心肌病理改變。

1.6心肌肥厚基因及心肌纖維化基因mRNA表達檢測采用qRT-PCR法，檢測各組心肌組織中心肌肥厚基因包括心房鈉尿因子(ANF)、骨骼肌肌動蛋白β1(ACTA1)、β肌球蛋白重鏈mRNA表達，心肌纖維化基因包括轉化生長因子β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)mRNA表達。

1.7心肌凋亡蛋白表達檢測采用Western blot法檢測各組心肌細胞中凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達。以兔抗人GAPDH 抗體(1∶5 000)作為內對照。抗原-抗體復合物用雙色紅外激光掃描儀進行掃膜。采用Image-Pro Plus軟件分析蛋白條帶積分光密度值(IOD)，以靶蛋白與GAPDH的IOD比值反映靶蛋白相對表達量。

1.8心肌細胞凋亡檢測將各組心肌組織標本用石蠟包埋后切片，使用TUNEL試劑盒染色，每張切片隨機取6個高倍鏡視野，檢測心肌細胞凋亡情況，計數100個細胞核中凋亡細胞核的個數作為凋亡指數。

2結果

2.1各組心功能比較見表1。

表1　各組心功能結果比較

注：與假手術組比較，*P<0.05，△P<0.01；與GFP組比較，#P<0.01。

2.2各組心肌組織病理改變HE染色：假手術組心室壁厚度正常，心肌細胞排列整齊、大小正常，細胞質均勻，細胞核染色均勻；GFP組心室壁厚度增厚，心肌細胞橫截面積增大；miR-455組較GFP組心室壁厚度進一步增厚，心肌細胞進一步增大，心肌細胞排列紊亂，細胞質濃染，細胞間距增大，細胞核空染增多。Masson染色：假手術組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細胞間隙，GFP組心肌膠原纖維較假手術組明顯增加，miR-455組心肌膠原纖維較GFP組明顯減少。

2.3各組心肌肥厚基因及心肌纖維化基因表達比較見表2。

表2　各組心肌肥厚基因、心肌纖維化基因表達比較±s,n=6)

注：與假手術組比較，△P<0.01；與GFP組比較，#P<0.01。

2.4各組心肌細胞凋亡蛋白表達比較詳見見表3、圖1。

2.5各組心肌細胞凋亡指數比較見表3。

表3　各組心肌細胞凋亡蛋白表達比較±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05，△P<0.01；與GFP組比較，▲P<0.05。

圖1　　　　各組心肌細胞Bax、Bcl-2蛋白表達

3討論

miRNAs是長21～25 nt的內源性非編碼小分子RNA，通過調節多種基因的表達廣泛參與心血管系統細胞的增殖、遷移、分化、凋亡等病理生理過程。研究發現，miR-350、miR-21、miR-23a、miR-24、miR-208、miR-195、miR-19等與心肌肥厚有關[1～3]，miR-29及miR-21與心肌纖維化有關[4,5]，miR-133a與缺血性心臟病有關[6,7]，miR-129與心力衰竭有關[8]。miR-455是一種新發現的miRNAs，其5′端有6個核苷酸序列，與鈣網蛋白(Calr)匹配完好，而Calr與心室重構關系密切，這一分子結構提示miR-455可能在心室重構的發生中發揮一定作用。

高血壓病時心臟的前后負荷增加，可導致左心室肥厚及心腔擴大，出現左心室重構。早期的左心室重構以心肌細胞肥大為主，是心臟對壓力負荷增加的代償，以降低升高的室壁張力，維持甚至增加射血分數。當病變進展到后期時，左心室重構以心肌凋亡和膠原纖維異常增加為主，出現EF進行性降低，成為導致心功能惡化、心力衰竭加重的重要原因。本研究發現，與假手術組相比，GFP組LVIDd增加、LVEDV增加、LVAWd增厚、EF降低，提示心室重構小鼠的心肌收縮力下降、EF降低，出現心功能降低；與GFP組相比，miR-455組LVIDd降低、LVEDV降低、LVAWd增厚、EF增加，提示miR-455改善了心功能，可能與其抑制心室重構進展有關。

心肌肥厚是心肌組織對高血壓時室壁張力增高的一種反應。在離體心肌組織和在體心臟中，室壁張力增高是導致心肌細胞肥大的直接刺激因素。這種效應可能由離子通道介導，通過調節細胞內pH或胞內信使分子如cAMP的濃度，從而使mRNA增多，促使心肌細胞蛋白質合成、出現心肌肥大。此外，心室重構后去甲腎上腺素α受體增多也可刺激心肌細胞增長，使腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性增高，加速蛋白質合成，促進心肌肥厚的發生。本研究發現，GFP組心肌組織病理呈心肌肥厚改變，心室壁厚度增厚，心肌細胞橫截面積增大，心肌肥厚基因ANF、ACTA1、β肌球蛋白重鏈mRNA表達均增加，提示心室重構小鼠出現心肌肥厚病理改變；與GFP組相比，miR-455組心肌肥厚病理改變程度減輕，心肌肥厚基因ANF、ACTA1 mRNA表達降低，提示miR-455可能通過抑制心肌肥厚基因的表達抑制心肌肥厚的進展，考慮GFP組可能進入心室重構的心力衰竭階段，而miR-455組尚停留于心肌肥厚的早期階段，可能與miR-455延緩心室重構進展有關。

在高血壓病血流動力學改變、神經-內分泌-細胞因子激活等作用下發生心臟重構后，可出現心肌間質的重構，主要表現為血管增生、交感神經元軸突增長、成纖維細胞增殖、早期Ⅲ型膠原mRNA表達、后期Ⅰ型膠原及前膠原蛋白mRNA增加等，導致Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加，出現左心室僵硬，影響其舒張功能[9]。本研究發現，GFP組心肌組織呈纖維化樣改變，心肌膠原纖維較假手術組明顯增加，心肌纖維化基因TGF-β1、CTGF mRNA的表達均增高，提示GFP組發生心肌纖維化；與GFP組相比，miR-455組心肌膠原纖維明顯減少，心肌纖維化基因TGF-β1、CTGF mRNA表達降低，提示miR-455抑制了心肌纖維化進展，可能與其抑制心肌纖維化基因表達有關。

細胞凋亡可能是導致心力衰竭的重要原因。心力衰竭終末期，平均每百萬個心肌細胞就有2 318個發生凋亡，比正常細胞高232倍[10]。衰竭心臟的特征性變化是由于細胞凋亡和壞死引起的進行性心肌細胞喪失、心肌肥大等。本研究發現，與假手術組相比，GFP組凋亡蛋白Bax表達增加、抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低、心肌細胞凋亡指數增高，提示GFP組心肌凋亡現象明顯；與GFP組相比，miR-455組凋亡蛋白Bax表達降低、抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加、心肌細胞凋亡指數降低，提示miR-455抑制了心室重構后的心肌細胞凋亡，可能與其下調Bax蛋白、上調Bcl-2蛋白表達有關。

參考文獻：

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[10] Olivetti G, Abbi R, Quaini F, et al. Apopotosis in the human heart[J]. N Engl J Med,1997,336(16):1131-1141.

(收稿日期：2015-08-08)

中圖分類號：R542.2；R544.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0039-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.013