七氟醚預處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織的保護作用及其機制探討

王民，楊永安，耿垚，劉芳，李偉，王小磊 (河北大學附屬醫院，河北保定 071000)

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七氟醚預處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織的保護作用及其機制探討

王民，楊永安，耿垚，劉芳，李偉，王小磊 (河北大學附屬醫院，河北保定 071000)

摘要：目的觀察七氟醚預處理對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并探討其可能機制。方法60只雄性健康昆明小鼠隨機分為假手術組、模型組和預處理組，每組20只。假手術組和模型組輸純氧氣60 min，預處理組輸入氧氣及2.4%七氟醚60 min，用純氧洗脫10 min。模型組和預處理組利用線栓法建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型，于再灌注24 h時，計算小鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比，利用RT-PCR檢測小鼠海馬組織中的TREK-2、Caspase-3 mRNA。結果預處理組和模型組小鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比較假手術組高，且預處理組較模型組低(P均<0.05)。預處理組和模型組小鼠海馬組織TREK-2 mRNA相對表達量較假手術組高，且預處理組較模型組高(P均<0.05)。預處理組和模型組小鼠海馬組織Caspase-3 mRNA相對表達量較假手術組高，且預處理組較模型組低(P均<0.05)。結論七氟醚預處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織具有保護作用，可能與其增加海馬組織TREK-2表達、減少Caspase-3表達有關。

關鍵詞：七氟醚；腦缺血再灌注損傷；TREK-2基因

腦缺血再灌注損傷作為神經外科較為常見的圍術期不良事件，嚴重影響手術治療效果及患者預后[1]。七氟醚作為常用的吸入性全麻藥，有研究[2]指出，顱腦手術行七氟醚預處理可有效保護腦組織，減輕缺血再灌注對腦組織的損傷作用。研究[3]表明，雙孔鉀通道含有4個跨膜片段與2個孔道結構，與中樞神經系統生理功能關系密切，在調節神經元膜電位及體溫、腦缺血保護等功能中發揮重要作用。TREK-2作為雙孔鉀通道重要類型，在中樞神經系統中分布具有特異性，可通過減少細胞外Ca2+內流而保護神經元細胞[4]。本研究觀察了七氟醚預處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織的保護作用，并探討其可能機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級雄性健康昆明小鼠60只由河南省實驗動物中心提供(合格證號：醫動字第99013號)，8周齡，體質量22～28 g，飼養于通風、清潔環境中，溫度20～24 ℃，相對濕度50%～70%，自由飲水。利用隨機數字表法將其隨機分為假手術組、模型組和預處理組，每組20只。

1.2主要試劑與設備七氟醚購自上海恒瑞醫藥有限公司(批準文號：國藥準字p0070172)，TREK-2、Caspase-3及內參引物均由上海生工公司設計完成，TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Gibco公司，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司，紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司，數碼相機購自日本Sony公司，PCR儀購自瑞士Roch公司。

1.3小鼠腦缺血再灌注損傷模型制備及七氟醚用法所有小鼠禁食12 h后，置于半封閉有機玻璃箱中，鈉石灰鋪于箱底，使箱內PCO2低于375 mmHg，并采取燈泡加熱，維持箱內溫度在35～38 ℃。箱側面留2個通氣孔，假手術組和模型組一孔用于輸入純氧氣60 min；預處理組一孔連接麻醉氣體揮發罐輸入氧氣及2.4%七氟醚60 min，用純氧洗脫10 min，另一孔連接麻醉氣體分析儀，對氧氣、七氟醚及二氧化碳進行監測。于60 min后，行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，根據文獻[5]中的方法利用線栓法構建小鼠缺血再灌注損傷模型。取頸部正中切口，對右側頸總動脈、頸外動脈進行分離，將頸外動脈分支進行結扎，將頸總動脈于近心端結扎，假手術組小鼠完成操作；模型組和預處理組小鼠繼續將頸總動脈遠端用血管夾進行夾閉，于頸總動脈分叉處剪一小口，并將50 mm長的尼龍魚線置入頸內動脈，直到出現輕微阻力時停止放入，深度為1.8～2.0 cm；缺血持續120 min后，將線栓取出使血液恢復灌注。手術操作過程中小鼠均自主呼吸，直腸溫度維持在37～38 ℃。麻醉清醒后，小鼠均放回籠子飼養，自由飲食、飲水。

1.4小鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比計算方法于再灌注24 h時，對所有小鼠神經功能缺損情況進行評估[6]：運動功能評分實驗(小鼠放地上可正常行走0分，能直線行走1分，往癱瘓側轉圈2分，倒向癱瘓側3分；將小鼠尾巴提起，后肢屈曲或前肢屈曲或頭部在30 s內偏離身體縱軸>10°記1分)、平衡功能評分實驗(完成并保持平衡記0分，將平衡木一端完全抓住記1分，將平衡木抱住時一個肢體出現滑落記2分，將平衡木抱住時兩個肢體滑落或旋轉超過60 s記3分，旋轉在41～60 s滑落記4分，旋轉在20～40 s滑落記5分，旋轉在20 s內滑落記6分)、反射或運動異常評分(角膜反射或羽翼反射或驚恐反應消失或出現肌張力障礙、抽搐、肌陣攣均記1分)。于神經功能缺損評估后，每組各取小鼠10只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后處死并取腦組織，置于冰鹽水15 min，于冠狀面對腦組織進行切片，厚度2 mm，置于37 ℃ TTC溶液中，行染色40 min，用甲醛固定24 h，利用數碼相機拍照后轉入電腦，用專業圖像分析軟件進行分析，為避免同側腦水腫對腦體積產生的影響，用對側正常腦組織體積進行計算。腦梗死體積百分比=(對側正常腦體積-同側正常腦體積)/對側正常腦體積×100%[7]。

1.5小鼠海馬組織TREK-2、Caspase-3 mRNA檢測采用熒光定量PCR。將每組余下的10只小鼠處死后，取海馬組織進行研磨，利用細胞裂解液進行裂解，用TRIzol總RNA提取試劑盒獲得總RNA，利用紫外分光光度計進行檢測，取A260/A280>1.80樣品完成后續實驗。利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板用PCR試劑盒完成PCR，TREK-2引物序列上游：5′-CGTCCATCGTCCCAAATT-3′，下游：5′-TTGGAGGAGTTTCCTACCG-3′；Caspase-3引物序列上游：5′-TCGAGGTCGACGGATTCGATG-3′，下游：5′-CCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性60 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續進行38個循環。每個樣品均設置3個平行反應復孔。以β-actin為內參，擴增產物經凝膠電泳后拍照，利用圖像分析軟件對條帶灰度值進行分析，獲得TREK-2 mRNA和Caspase-3 mRNA相對表達量。

2結果

3組小鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比比較見表1。3組小鼠海馬組織TREK-2、Caspase-3 mRNA表達比較見表2。

表1　　　　3組小鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

表2　　　　3組小鼠海馬組織TREK-2、Caspase-3 mRNA

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3討論

腦缺血再灌注損傷作為神經外科圍術期常見的不良反應，嚴重影響手術治療效果及患者預后，增加了患者手術風險[8]。因此，如何有效預防或減輕腦缺血再灌注損傷已成為臨床研究重點。本研究參考文獻[5]采用線栓法制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型，結果顯示預處理組和模型組小鼠神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比均高于假手術組，說明小鼠腦缺血再灌注損傷模型建立成功。在確定七氟醚預處理吸入劑量時，主要參照有關文獻[9]及預實驗結果，本研究采取麻醉氣體揮發罐輸入氧氣及2.4%七氟醚60 min進行處理。

TREK-2是重要的雙孔鉀通道亞型，可被細胞膨脹、張力、負壓等機械張力和多不飽和脂肪酸激活，在病理狀態下可能發揮保護作用[10]。本研究顯示，當小鼠發生腦缺血再灌注損傷時海馬組織中TREK-2 mRNA相對表達量顯著增加，且七氟醚預處理會進一步增加TREK-2表達。TREK-2通道的開放增加可引發神經元超級化，抑制電壓依賴性鈣離子通道及NMDA受體相關鈣通道，減少Ca2+內流，有效保護神經元。TREK-2表達升高可能是神經元損傷后的反饋性保護調節機制，而七氟醚預處理更有利于TREK-2的表達[11]。在發生缺血再灌注損傷時，七氟醚預處理可進一步促進TREK-2通道大量開放，鉀電流增加可對靜息膜電位進行調節而抑制其他離子通道的活性，從而有效保護腦細胞[12]，同時，TREK-2通道大量開放可使神經元超極化，通過抑制鈣通道而減少Ca2+內流，減少細胞內Ca2+水平而減少細胞凋亡的發生。Caspase-3作為凋亡執行蛋白，其表達水平可反映細胞發生凋亡的程度[13]。本研究結果還顯示，七氟醚預處理可抑制海馬組織中Caspase-3表達，說明七氟醚預處理有助于保護腦組織，減少神經元凋亡的發生。

綜上所述，七氟醚預處理對缺血再灌注損傷小鼠腦組織具有保護作用，可能與其增加海馬組織TREK-2表達、減少Caspase-3表達有關。

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(收稿日期：2015-10-05)

中圖分類號：R743.33

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.009

通信作者：王小磊(E-mail： 2019945399@qq.com)