陳俊軼 吳文福 成榮敏 尹慧敏 息裕博
摘 要:利用酶水解法和酶比色法2種方法來檢測馬鈴薯自由淀粉的含量[1],結果表明與傳統的酶水解法相比,酶比色法利用多個函數擬合的方法能夠科學的計算出標準工作曲線,更加準確、合理,并且在測量結果基本一致的前提下大大縮短了時間。
關鍵詞:自由淀粉;酶水解法;酶比色法;吸光度;標準工作曲線
中圖分類號:S532 文獻標識碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20160532010
隨著國家的馬鈴薯主糧化戰略的發布,關于馬鈴薯儲量產業化的問題也被重視[2],而儲量的關鍵在于提高其儲存時間。馬鈴薯鮮薯最多能夠儲存8個月,在合適的條件下,馬鈴薯全粉可以儲藏10a以上。馬鈴薯淀粉的含量又作為檢測馬鈴薯全粉品質好壞的重要指標,目前最常用的檢測淀粉含量的方法分別是酶水解法、酶比色法。本實驗用上述的2個方法檢測淀粉含量,根據標準工作曲線、直線回歸方程的相關系數以及檢測結果作為依據來評價2種測量方法的準確度。
1 材料與方法
1.1 材料
樣品1:將新鮮馬鈴薯用烘干設備烘干7h制成全粉;樣品2:將新鮮馬鈴薯用烘干設備烘干10h后制成全粉;樣品3:以及市場購買辛普勞雪花熟粉。
1.2試劑與儀器
甲基紅指示液:稱取甲基紅0.2g,用少量乙醇溶解后,定容至100mL。堿性酒石酸銅甲液:稱取15g硫酸銅及0.5g亞甲藍,溶于水中并定容至1000mL。堿性酒石酸銅乙液:稱取50g酒石酸鉀鈉,75g氫氧化鈉溶于水中,再加入4g亞鐵氰化鉀,完全溶解后,定容至1000mL,存放于橡膠塞玻璃瓶中。淀粉酶溶液:稱取淀粉酶0.5g,加100mL水溶解。淀粉葡萄糖酶緩沖液:淀粉葡萄糖苷酶2mg,0.1mol/L檸檬酸和檸檬酸鈉組成的緩沖液,其中緩沖液pH為4.6,將它們定容至66mL。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶試劑溶液:磷酸鹽緩沖液200mL,再加入4-氨基安替比林0.0626g,再和200mL的0.022mol/L苯酚溶液混合。將400mL混合好的溶液中加入葡萄糖氧化酶8mg,過氧化物酶13.33g至酶溶解。酶水解法葡萄糖標準溶液:稱取1g經過105℃干燥2h的葡萄糖,加水和5mL鹽酸溶液,定容至1000mL。酶比色法葡萄糖標準溶液的制備:稱取0.2g葡萄糖,用水溶解并稀釋至100mL。
STARTER3100實驗室pH計(奧豪斯儀器有限公司);實驗室天平(賽多利斯科學儀器);加熱磁力攪拌器(IKAC-MAG HS7);TU-1900雙光束紫外分光光度計(北京普析通用儀器制造有限責任公司);HSS-1數字式超級恒溫浴槽(成都儀器廠)。
1.3 方法
1.3.1 酶水解法[3]
1.3.1.1 樣品處理液制備
在150mL錐形瓶中放入100mL 65.5℃的水,立刻向瓶中傾入1.0g樣品,迅速搖晃以免結塊。在65.5℃水浴中間歇搖晃3min,再用力搖晃30s,使顆粒完全分開。立即抽濾,然后將濾液全部倒入250mL燒杯中,加入20mL淀粉酶溶液在60℃水浴中恒溫1h并間歇攪拌。然后取1滴此液加1滴碘溶液,應不顯示藍色,如果顯示藍色則應繼續恒溫直到加碘溶液不顯藍色為止。然后加熱至沸,冷卻后倒入250mL容量瓶中定容混勻。再抽濾,棄去約50mL初濾液,保留剩下200mL濾液,取50mL置于250mL錐形瓶中加5mL鹽酸(1+1),裝上冷凝管在沸水浴中回流1h。冷后加入2滴甲基紅指示液,用氫氧化鈉滴定至中和,溶液轉入100mL容量瓶中,加水至刻度,混勻備用。
1.3.1.2 標定堿性酒石酸銅溶液
用150mL錐形瓶吸取5mL堿性酒石酸銅甲液和5mL堿性酒石酸銅乙液,加入10mL蒸餾水。調整加熱溫度以保證試劑能在2min內沸騰。滴加標準葡萄糖溶液,直至溶液內藍色剛好褪去,記錄消耗標準葡萄糖溶液的體積[4]。
1.3.1.3 試樣溶液測定
用1.3.1.2方法,將標準葡萄糖溶液換成1.3.1.1試樣溶液,記錄消耗的試樣溶液體積。同時量取50mL水及試樣處理時相同量的淀粉酶溶液,用反滴定法做空白。
1.3.2 酶比色法
1.3.2.1 樣品處理液制備
在150mL錐形瓶中放入100mL 65.5℃的水,立刻向瓶中傾入1.0g樣品,迅速搖晃以免結塊。在65.5℃水浴中間歇搖晃3min,再用力搖晃30s,使顆粒完全分開。立即抽濾,取4mL過濾液和1mL淀粉葡萄糖酶稀釋液于10mL具塞試管中,在60℃水浴中酶解1h,取出冷卻后加入5mL葡萄糖氧化酶-過氧化物酶試劑溶液,放入40℃水浴中顯色20min,最后靜置10min后在分光光度計上505nm波長處測定吸光度[5]。
1.3.2.2 酶空白和濾液空白的制備
酶空白:4mL蒸餾水加1mL淀粉葡萄糖酶稀釋;濾液空白:4mL濾液加1mL蒸餾水。
2 計算方法與實驗數據
2.1 酶水解法
X:淀粉含量;A1:標定時消耗的葡萄糖質量(mg);A2:用反滴定法測空白實驗時消耗的葡萄糖的質量(mg);m:稱取的樣品質量(g);V:滴定時測定樣品消耗的質量(mg)。
2.2 酶比色法
2.2.1 標準工作曲線
擬合曲線公式:y=0.00169x+0.0008(相關系數R=0.9995)
圖1 酶比色法標準工作曲線圖
2.2.2 淀粉含量計算公式
自由淀粉含量(%)=(C1-C2-C3)×2.5×9/W
C1:測試樣品的吸光度與標準曲線對應的葡萄糖質量(ug) ;C2:酶空白的吸光度與標準曲線對應的葡萄糖質量(ug); C3:濾液空白的吸光度與標準曲線對應的葡萄糖質量(ug);W:稱取樣品質量(mg)。
2.3 實驗數據
3 討論
酶水解法沒有標準工作曲線可以制作,步驟繁瑣,滴定的同時要求溶液持續沸騰,相對麻煩,而且為了確保數據可靠,需要每組至少6個平行滴定,由于要求甲液和乙液必須在2min內沸騰,所以滴定的成功率也特別低,完成一個樣品大概4h左右,而且會大量消耗試劑,總的來說費時費力[6]。利用比色法測定出來的結果與酶水解法相比,雖然每個樣品的數值有差異,但是基本的走勢是一樣的,標準曲線科學、精確,可以直接根據吸光度對應的工作曲線上的濃度求的含量,完成一個樣品大概2h,大大的縮短了工作時間,而且數據誤差都在實驗所允許的范圍內[7]。
2種方法的共同點:樣品的預處理方法一樣,都是利用自由淀粉在65.5℃能分離出來,選擇在該溫度分散并抽濾。與傳統的酶水解法相比,酶比色法利用多個函數擬合的方法科學的計算出標準工作曲線,更加的準確合理。并且在測量結果基本一致的前提下大大縮短了時間。
參考文獻
[1]陳俊芳,周裔彬,白麗,等.兩種方法測定板栗直鏈淀粉含量的比較[J].中國糧油學報,2010,25(4):93-95.
[2]呂耀昌,張濤.土豆顆粒全粉中自由淀粉的測定方法研究[J]. 食品科學,2000,21(10):44-45.
[3]食品中淀粉的測定酶水解法;GB/T5009.9-2008[S].
[4] J. H. M. Hovenkamp-Hermelink,J. N. Vries,P. Adamse,E. Jacobsen,B. Witholt,W. J. Feenstra.Rapid estimation of the amylose,opectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato[J]. Potato Research .1988(2).
[5]于魯浩,馬耀宏,楊俊慧,等.馬鈴薯塊莖中淀粉含量的快速測定方法[J].食品科技,2012(3):279-283.
[6] J M Herrero-Martínez, P J Schoenmakers, W T Kok;Determination of the amylose-amylopectin ratio of starches by iodine-affinity capillary electrophoresis[J].Available online 28,july,2004.
[7]劉佳佳,李子騏.硼酸—檸檬酸比色法測銀杏枝葉中黃酮苷含量[J]. 食品與發酵工業,1999, 25(6):42-44.