基于液相色譜

林敏 熊昕 余婷婷 張莉 劉迪

三唑酮是一種高效、低毒、持效期長、內吸性強的三唑類殺菌劑，但隨著農藥的濫用，各種農藥對環境的污染越來越嚴重，因此國內外對三唑酮殘留限量有較嚴格的規定，目前我國現有農藥檢測方法缺點是操作繁瑣，同時準確度不高，檢測過程時間長，既繁瑣，又不安全。高效液相色譜法是一種較為先進的檢測技術，可以有效檢測食品安全問題。在食品檢測中，利用安全、高效的檢測方法，可以及時檢測出食品中的有害成分，保障食品安全，可以防止有害食品進入市場，有效降低食品的安全風險，目前被廣泛應用于食品檢測工作當中。

試驗材料

材料。（1）儀器與設備。超高效液相色譜質譜聯用儀，Pipet-LiteXLS型移液器，RetschGM200型組織搗碎機，TGL-16M型高速離心機，N-EVAP型氮吹儀，Sep-PakVac型氨基固相萃取柱，RE-52AA型旋轉蒸發器。（2）試劑和材料。三唑酮，乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，甲苯為優級純，實驗室用水為超純水；氯化鈉為優級純，無水硫酸鈉為分析純，用前在650℃下灼燒4h，貯于干燥器中，冷卻后備用。

三唑酮標準溶液：精密稱取三唑酮標準品0.1000g于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，此溶液1mL相當于1.00mg三唑酮。臨用時，用乙腈稀釋至所需的質量濃度。

色譜條件。不同流動相色譜條件見表1。色譜柱：WATERSACQUITYC18（50×2.1mm，1.7μm）型；進樣量：10μL；柱溫：40℃。

質譜條件。電離模式：ESI+；掃描方式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：3.0kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔流速：50L/Hr；脫溶劑氣流速：900L/Hr；碰撞氣流速：0.17mL/min；母離子：294.2；子離子：197.1（定量離子），225.2；錐孔電壓：25V；碰撞能量：15，13eV。

試驗方法。（1）樣品的提取。稱取樣品20 g于80 mL塑料離心管中，加入40 mL乙腈，用高速組織搗碎機在轉速15 000 r/min 下勻漿提取1 min，加入5 g NaCl，再勻漿提取1min，以4 000 r/min離心5min，取上清液20 mL （相當于10 g 試樣量），在40 ℃水浴中旋轉濃縮至1 mL，待凈化。（2）提取液的凈化。在Sep-Pak Vac 型柱中加入約2 cm 高無水硫酸鈉，并放入下接雞心瓶的固定架上。加樣前先用4 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 預洗柱，當液面到達硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉移至凈化柱上，并更換新雞心瓶接收。再每次用2 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 洗滌樣液瓶3 次，并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50 mL 貯液器， 用25 mL 乙腈+ 甲苯（3+1） 洗脫農藥及相關化學品合并于雞心瓶中，并在40 ℃水浴中旋轉濃縮至凈干。將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干，迅速加入1 mL 的乙腈+ 水（3+2）混勻，經0.2 μm 濾膜過濾，供UPLC-MS/MS 分析。

線性關系。選擇不含有三唑酮的蘋果為果蔬樣品代表。準確稱取20 g （精確至0.01 g） 未添加三唑酮的蘋果勻漿液，準確加入三唑酮的對照品溶液，使樣品中三唑酮的質量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0， 100.0 ng/mL， 分別對這些溶液進行UPLCMS/MS 分析，記錄MRM 圖，得峰面積，并對各溶液的峰面積和質量濃度進行線性回歸分析，得到線性回歸方程和相關系數。

檢出限與定量限。檢出限與定量限是衡量方法靈敏度的指標之一。將對照品溶液逐級稀釋， 分別對這些溶液進行UPLC-MS/MS 分析，記錄MRM 圖中定量離子的信噪比，以3 倍信噪比計算得出檢出限，10 倍信噪比計算得出定量限。

回收率和精密度測定。選擇不含有三唑酮的西紅柿為果蔬樣品代表。按照加樣回收法低、中、高3 個水平對空白樣品進行加標，每個質量濃度平行3 份，使西紅柿樣品中三唑酮的添加量為0.125，0.250，0.500 μg/kg，按照1.4 方法進行樣品處理。按照色譜- 質譜方法進樣，計算每個質量濃度下的回收率，同時計算相對標準偏差。

結果與分析

線性關系。選用三唑酮的溶液質量濃度為1.0-100.0 ng/mL的樣品溶液進樣分析，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線。得到標準曲線為Y=2 091.3X-778.58，R2=0.999 8。線性關系良好，完全符合方法學要求。

三唑酮的標準工作曲線見圖1，三唑酮標準溶液的MRM 見圖2。

檢出限與定量限。對逐級稀釋溶液中三唑酮的質量濃度進行分析，將所得MRM 圖中的色譜峰進行信噪比計算。質量濃度為0.5 ng/mL 時，信噪比大于3 倍空白信噪比，得出檢出限為0.5 ng/mL。質量濃度為1.0 ng/mL 時，信噪比大于10 倍空白信噪比，得出定量限為1.0 ng/mL。

回收率與精密度。蘋果樣品中三唑酮的回收率與精密度見表2

蘋果樣品中回收率為82.8%～94.7%。根據國家標準GB/T 27404—2008 實驗室質量控制規范食品理化檢測中對檢測方法確認的技術要求中，被檢測組分濃度含量小于0.1 mg/kg 時，回收率達到60%～120%，即符合方法學的要求。計算各質量濃度下平行3次的試驗結果，計算相對標準偏差。

實際樣品分析。依照以上的試驗方法對市場上出售的幾種蔬菜水果進行檢測，結果表明，結果表明被檢測的幾種蔬菜水果中，均未檢出三唑酮。

討論

試驗建立了一種快速檢測水果蔬菜中三唑酮農藥殘留的液相色譜-串聯質譜法的檢測技術， 該方法回收率在84.9%～89.3%之間，完全符合方法學要求。該方法前處理簡單，具有靈敏度高、分離效果好、重復性強等特點，適用于短時間內大批量測定蔬菜水果中的三唑酮。

（作者單位：林敏 余婷婷 張莉 劉迪 湖北省食品質量安全監督檢驗研究院；熊昕 湖北省食品藥品監督管理局技術審評核查中心）