多種食源性致病菌快速檢測(cè)方法

劉曉

食品中污染的病原細(xì)菌是引起食源性疾病的主要因素之一，每年向衛(wèi)生部上報(bào)的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且大部分是由食源性致病菌引起的。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。由此可見，食源性疾病與食品污染問題已成為世界范圍內(nèi)舉足輕重的公共衛(wèi)生問題。因此，建立科學(xué)、準(zhǔn)確、全面的食源性致病菌檢測(cè)體系，是保障食品安全的重要手段，對(duì)預(yù)防和控制微生物性食物中毒事件起著重要的作用。

目前對(duì)這些食源性致病菌的檢測(cè)，主要依靠常規(guī)的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)方法，一般需4～7d，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)耗力，檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度不高，在檢測(cè)速度、敏感性與特異性等方面也有局限性。隨著微生物學(xué)的快速發(fā)展，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中引入了越來越多的新技術(shù)，有關(guān)食源性致病菌檢測(cè)的免疫磁性分離法、酶聯(lián)免疫測(cè)定方法、核酸雜交技術(shù)和PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)單快速而得到廣泛的應(yīng)用其中以高通量、靈敏、特異、適用范圍廣和低成本為特點(diǎn)的快速檢測(cè)方法受到越來越多的關(guān)注，而在這些方法中又以DNA檢測(cè)為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)方法應(yīng)用尤為廣泛。同時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法、基于免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法等檢測(cè)手段也在進(jìn)一步地完善和改進(jìn)。本文通過探討目前常用食源性致病菌檢測(cè)方法，對(duì)不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行闡述和分析。

常規(guī)食品微生物檢測(cè)方法包括反復(fù)增菌、菌落分離及多種生化和血清學(xué)鑒別實(shí)驗(yàn)，食品中致病菌的常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，并且檢測(cè)結(jié)束后可獲得目標(biāo)致病菌，供后續(xù)研究，例如通過對(duì)從污染食品中檢出的致病菌和從臨床病人中分離的致病菌進(jìn)行分析比較，并結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，可以揭示污染食品和病人之間是否存在關(guān)聯(lián)，即是否是由于食用了污染食品而導(dǎo)致的臨床病例的出現(xiàn)，從而為食品安全預(yù)警提供實(shí)驗(yàn)室的支持。正是由于這些優(yōu)點(diǎn)，所以截至到目前，世界上很多國(guó)家仍將常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法列為食品微生物檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，例如我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789食品微生物檢測(cè)系列，美國(guó)食品藥品管理局（FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）的細(xì)菌分析手冊(cè)（BacteriologicalAnalyticalManual，BAM）等等。由此可見，食品中致病菌的常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法是從事食品微生物檢驗(yàn)的技術(shù)人員所必須掌握的最基礎(chǔ)方法。如果能夠在此基礎(chǔ)上，結(jié)合一些以核酸分析為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法，進(jìn)行初步篩選，則可減少大量的工作，有效地提高檢測(cè)效率。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELLISA）

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的基本原理是將抗原或抗體預(yù)先吸附于固相載體表面，再加入受檢樣品和酶標(biāo)抗體，進(jìn)行免疫酶染色，最后經(jīng)固相載體上的酶催化產(chǎn)生顏色變化，從而判斷受檢樣品是否含有目的抗原。同時(shí)通過分析有色產(chǎn)物量可以確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。例如沙門氏菌ELLISA法是將細(xì)菌經(jīng)離心之后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，然后放在多孔板中固定，加抗鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛抗體作用，再加第二酶標(biāo)抗體作尉，最后以底物顯色，產(chǎn)棕色或蘭色為陽(yáng)性。這種方法最小檢出量可達(dá)10cfu/mL～10cfu/mL，其缺點(diǎn)是會(huì)引起假陽(yáng)性反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對(duì)不同的細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ELISA法對(duì)多種食源性致病菌的靈敏度和特異性較好。但ELISA對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分，且對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有交叉反應(yīng)。許多學(xué)者把其他方法與免疫學(xué)方法結(jié)合起來以提高檢測(cè)靈敏性，大大縮短了樣品檢測(cè)周期。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物及食品學(xué)科的眾多領(lǐng)域，尤其在食品中致病微生物檢測(cè)方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值。熒光定量PCR技術(shù)巧妙地利用了PCR技術(shù)核酸擴(kuò)增的高效性，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性以及計(jì)量高準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又克服了普通PCR技術(shù)易污染、不能定量、探針雜交靈敏度不高、分離洗脫條件不易控制等不足，在致病菌基因診斷中有著廣闊的應(yīng)用前景。金大智等運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR（Real—timePCR）技術(shù)建立對(duì)食品中單增李氏菌進(jìn)行檢測(cè)的快速方法，設(shè)計(jì)的引物和探針的序列特異性強(qiáng)，省去凝膠電泳的繁瑣，降低了污染的可能性。以沙門氏菌的檢測(cè)為例，杜邦公司BAX系統(tǒng)不但能檢測(cè)到所有的沙門氏菌血清型，而且可以排除所有的非沙門氏菌菌株。在沒有使用PCR技術(shù)之前，所有的增菌方法都需要大量的手工操作。檢測(cè)人員操作技術(shù)差異，或因不斷轉(zhuǎn)移樣品而導(dǎo)致樣品發(fā)生交叉污染等原因，都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性。根據(jù)致病菌的特異基因序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，是現(xiàn)階段檢測(cè)致病菌的最快速準(zhǔn)確的方法。針對(duì)某種病原菌，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要長(zhǎng)達(dá)1星期的時(shí)間才能得到檢測(cè)結(jié)果。而采用PCR技術(shù)，對(duì)絕大多數(shù)致病菌而言，在第二天就可以得到檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠，而且還可改進(jìn)成定量競(jìng)爭(zhēng)PCR，對(duì)標(biāo)本中靶序列進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)PCR操作簡(jiǎn)單，閉管檢測(cè)，減少污染，靈敏度高，并且可以在PCR結(jié)束或PCR過程進(jìn)行同步定性或定量檢測(cè)，而且可以進(jìn)行大規(guī)模快速檢測(cè)。

食品中致病菌的快速定量、定性的檢測(cè)是確保食品安全的前提，在該領(lǐng)域目前仍有許多問題需要解決，如提高分析靈敏度及重復(fù)性、降低自動(dòng)化儀器和試劑成本、簡(jiǎn)化樣品處理及多基因同時(shí)分析等。食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)在不斷的發(fā)展和創(chuàng)新過程中，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)該指出的是，快速檢測(cè)方法的應(yīng)用并不意味著完全拋棄分離培養(yǎng)方法。在某些情況下，特別是涉及一些需要最終結(jié)果的樣品時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方法還是必不可少的，也是世界上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。

（作者單位：山東省青島市黃島區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心）