刺狀無梗囊霉對番茄黃化曲葉病毒病田間防效

李可 高彥林 王楚南 蔣春號 郭堅華

摘 要：利用前期試驗結果篩選出叢枝菌根真菌刺狀無梗囊霉XJ27，將菌根番茄苗移栽至江蘇大豐市大棚中，30 d后進行生物量數據統計分析，結果發現，接種XJ27后，番茄移栽成活率以及生物量顯著增加；大田間自然發病采樣后，經特異性引物檢測，確定為番茄黃化曲葉病毒病，經病害嚴重度統計后，發現刺狀無梗囊霉XJ27對番茄黃化曲葉病毒病具有一定的生防效果，防效達到50.44%。

關鍵詞：刺狀無梗囊霉；促生作用；番茄黃化曲葉病毒病

中圖分類號：S641.2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）16-0077-04

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）是自然界中普遍存在的植物和真菌的互惠互利共生體，植物能夠為菌根真菌提供生長需要的碳源和能量，AM真菌可以通過根外菌絲擴大根系吸收范圍，從而提高植物根系對養分和水分的吸收，尤其是對土壤磷的吸收[1]。除了在改善植物養分吸收方面的作用外，AM真菌與植物病害的關系也是目前研究的重點。

隨著番茄種植面積的逐年增加，我國番茄種植上陸續出現多種病害問題，其中由雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）引起的番茄黃化曲葉病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease，TYLCD）為害較為嚴重。該病毒由煙粉虱介導傳播，是一種具有孿生顆粒形態的單鏈環狀DNA植物病毒[2]。近年來，TYLCD在世界范圍內大暴發，遍及40多個國家和地區，已成為番茄生產上的毀滅性病害[3]，給農民的生產造成巨大的經濟損失[4]，嚴重制約了番茄產業的健康發展。目前，主要通過培育抗性品種和采用化學藥劑來防治煙粉虱防治該病害，但效果不穩定。國內外還沒有報道對TYLCV有顯著抑制效果的生防菌，國內外市場上也沒有出現能有效防治番茄黃化曲葉病毒病的生物農藥。本研究首次發現AM真菌可以在一定程度上降低番茄黃化曲葉病毒病的為害程度，為今后生防產品的研發以及利用奠定了一定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄（Lycopersicon esculentum）品種為合作 903，于江蘇省農業科學研究院購買。

供試刺狀無梗囊霉XJ27（Acaulospora spinosa），分離自新疆地區番茄根際土壤。實驗室之前的研究表明XJ27對Micro-Tom番茄具有促生及提高果實中番茄紅素含量的效果[4]。

1.2 試驗方法

①田間處理以及小區設置 試驗于2014年在江蘇大豐市進行，共設置2個處理，即接種刺狀無梗囊霉XJ27組和空白對照組（CK）。將番茄種子用10% H2O2表面消毒 10 min，用無菌水洗凈后晾干備用。先在穴盤內進行菌根苗培育[4]，20 d后連根部土壤一起移栽至田間。每株番茄根部施用2 g AM菌劑（每份菌劑大約100個孢子），對照組加入等量滅菌菌劑。每個處理4個小區，每小區3壟，每壟20株，每處理共240株。生長期間按常規方法進行管理。

④移栽成活率以及生物量檢測 移栽后30 d（即育苗后50 d）進行移栽成活率的統計，植株生物量的測定，每小區取24株，每處理共96株，分別測定莖粗、株高及葉片數。生物量測定方法：將植株用蒸餾水沖洗，分為地上、根，用吸水紙吸干表面水分，測定鮮質量（FW），記錄葉片數。

⑤試驗田土壤相關測定 番茄移栽30 d后，使用五點取樣法對番茄根圍土壤進行采樣。采集方法：小心地從盆缽中收集根圍土樣和非根圍土樣（根圍土樣的樣品包括3株幼苗緊緊附著于根系上的土壤），取樣時，將幼苗根部挖開，小心的用刷子刷下根上附著的土樣，取完后再將根部埋好，確保根部的完整性。并使用土壤養分測定儀對其速效N、P和K 3種元素進行測定。

⑥病害鑒定 使用植物DNA提取試劑盒提取植物的總DNA，利用雙生病毒通用引物進行PCR擴增。

擴增引物：PF-TAATATTACCKGWKGVCCSC；PR-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA。

擴增程序：95℃預變性4 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，變性到延伸34個循環，最后72℃，10 min。

⑦病害分級標準 育苗后70 d按照TYLCD病情指數分級標準[5]進行病害嚴重度以及生防效果的計算。

病害嚴重度（%）=[∑（發病植株數×病級數）/（總植株數×最高病級數）]×100%。

生防效果（%）=[（對照病害嚴重度-處理病害嚴重度）/對照病害嚴重度]×100%。

1.3 數據處理

試驗數據采用DPS軟件統計分析，采用LSD法進行多重比較，于5%顯著水平下檢驗各處理平均值間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 番茄病害的鑒定以及生防效果測定

使用植物DNA提取試劑盒提取田間番茄病葉的總DNA，利用雙生病毒通用引物進行PCR擴增。擴增出660 bp左右長度的片段，經鑒定為番茄黃化曲葉病毒（圖1）。據病害分級標準，對田間病害發生情況進行統計分級，最后計算出處理組的生防效果。結果顯示，刺狀無梗囊霉XJ27對番茄黃化曲葉病毒病有一定的生防效果，防效為50.44%（表1）。

2.2 AM真菌對移栽番茄的促生作用

菌根苗移栽后50 d，刺狀無梗囊霉處理組的番茄存活率、株高、莖粗以及葉片數均顯著高于對照組（表2），表明刺狀無梗囊霉XJ27對番茄具有一定的促生作用。

2.3 AM真菌對土壤營養元素的影響

番茄移栽后50 d，測定其根圍土壤中營養元素的變化情況。試驗結果顯示，AM真菌處理組顯著增加了土壤中有效P的含量，增加了有效K的含量（表3）。

3 討論與結論

TYLCV 已成為全球番茄種植的巨大威脅。檢測植株體內病毒的含量有利于了解病毒的發生、流行動態，為控制其蔓延打下基礎。目前，常用于檢測TYLCV的方法有生物學檢測法、血清學檢測法和分子生物學檢測法等。Martinez-Culebras等[6]設計了2對病毒引物，其中一對可以同時檢測到 TYLCV 和 TYLCSV，另一對卻只能檢測到 TYLCSV，因此這2對引物可以用于區別TYLCV 和 TYLCSV。

本試驗中根據番茄前期病株癥狀，初步判定為病毒病害。隨后采樣，根據雙生病毒基因組的DNA特征，設計針對該種病毒的特異性引物，使其只能檢測該種病毒，最終確定該病毒為TYLCV。

最近10 a中，AM真菌被發現可以誘導植物抵御植株地上部病害[7～9]，因此當前AM真菌已經作為一種代替化學農藥及殺蟲劑的生物肥料及農藥來研究[10～12]，為其在可持續農業發展應用中提供了理論依據 。有研究發現，使用分根系統，AM真菌對不同的病原物都具有誘導其產生系統抗性的能力。但是AM真菌的誘導系統抗病不僅僅局限于根系，Fritz 等[13]的研究發現，AM真菌對番茄葉部病害同樣具有抗性。研究認為，菌根植物表現出抗性主要表現為昆蟲拒食素的積累[14]、抗病相關基因的轉錄調節[15]、分泌更多的揮發性物質，吸引蚜蟲的天敵寄生蜂[16]。因此，推測AM真菌減輕病害發生程度主要是因為AM真菌在與植物的共生過程中，誘導植物地上部產生系統防御，或是誘導植物植株地上部分泌出某些物質，從而抑制了煙粉虱的傳毒過程。

本試驗結果表明，AM真菌可以提高番茄植株對土壤中營養元素的利用率，這與前人的研究結果相符。其原理是AM真菌活化了土壤中的難溶營養元素，使這些元素更易于被植株轉運利用。本研究首次發現AM真菌對番茄黃化曲葉病毒病具有一定的生防效果，但是對其內在的機理還需進行深入研究。

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Abstract： We inoculated AMF XJ27 screened out in previous experiments on tomato seedlings， and transplanted them to the field. After 30 days， we analyzed the biomass data of different treatments. The results showed that AMF treatment had increased the biomass and survival rate of tomato. We also tested the leaf sample of disease plants， and it was diagnosed as tomato yellow leaf curl disease （TYLCD）. After the determination of disease severity， the results showed that AMF XJ27 had a certain biocontrol effect on tomato yellow leaf virus disease， which was 50.44%.

Key words： Acaulospora spinosa； Growth promoting effect； Tomato yellow leaf curl disease