參竹心康湯對慢性心衰大鼠心肌纖維化及Smad2的影響

曹丕鋼 喻正科 高欣 王國倩

摘要：目的 觀察參竹心康湯對慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的干預效果，并與卡托普利比較，探討參竹心康湯對慢性心力衰竭心肌纖維化的影響及相關機制，以期為評價中藥對慢性心力衰竭的療效及研究提供一客觀依據，并為參竹心康湯的進一步深入研究和市場推廣奠定理論基礎。方法 72只SD大鼠隨機分為六組：假手術組、模型組、卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組，每組12只。采用腹主動脈縮窄法制作心衰大鼠模型。造模成功后，假手術組、模型組以蒸餾水10ml/kg灌胃，卡托普利組以卡托普利混懸液7.8mg/kg灌胃，小劑量組、中劑量組、大劑量組分別以中藥煎液11g/kg、22g/kg、44g/kg灌胃，1次/d，連續灌胃8w。放射免疫法檢測大鼠心肌Smda2水平、堿水解法檢測心肌組織羥脯氨酸（HYP）含量。結果 模型組Smad2與HYP 水平明顯高于假手術組，卡托普利組、 參竹心康湯組上述指標均明顯低于模型組。結論 參竹心康湯有抗慢性心力衰竭心肌纖維化的作用，其機制可能與抑制Smad2表達有關。

關鍵詞：慢性心力衰竭；心肌纖維化；Smad2；參竹心康湯

慢性心力衰竭（CHF）是由于各種器質性或者功能性心臟疾病損害心室充盈或射血功能的一組綜合征，是多種心血管疾病的嚴重階段[1]，也是多數器質性心臟病患者難以避免的結局[2]。隨著生活質量的改善和人口老齡化的進展，CHF的患病人數也日益增加，給國家和社會帶來沉重的負擔。CHF的患病率和死亡率很高并正在逐年增加[3]，其對社會的影響也相當大，因此積極探討心衰的治療，發揮中醫藥的作用勢在必行。

目前認為CHF是一種細胞因子參與的神經內分泌過度激活的臨床綜合征，心室重塑是導致心力衰竭的基本機制[4]，心室重塑包括心肌肥厚和心肌間質纖維化，心肌纖維化（MF）和CHF有著密切的聯系，已成為心衰治療的新靶標[5]。

參竹心康湯是筆者多年臨床經驗的結晶，其前期研究已證明參竹心康湯能有效的治療CHF[6]，其治療CHF的機制是否和抗心肌纖維化有關，及其抗心肌纖維化的效果和可能的機制還未行相關研究，故現擬通過參竹心康湯治療CHF大鼠，以腹主動脈縮窄法（AAC）復制大鼠心力衰竭模型，以羥脯氨酸（HYP）為檢測MF的指標，探討參竹心康湯對Smad2的影響，明確依據益氣養陰、活血化瘀法組方的參竹心康湯對慢性心力衰竭心肌纖維化的療效及相關機制，以期為評價中藥對CHF的療效及研究提供一客觀依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD 大鼠72 只，清潔級，體質量（220±10）g。購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號 SCXK（湘）2013-0004，動物合格證號（006737）。常規飼料飼養，自由飲水。

1.2主要藥品 參竹心康湯：黨參20g、麥冬10g、黃芪20g、五味子6g、玉竹15g、丹參20g等。中藥飲片由我院附屬醫院按照2010年《中華人民共和國藥典》規定購入，由湖南省中醫藥研究院附屬醫院藥劑科制備成含生藥4.5g/ml的中藥煎液，自然冷卻后置于4℃冰箱冷藏備用。卡托普利片：湖南湘雅制藥有限公司，批號為20130024。購置卡托普利片后研磨成極細粉末，加入蒸餾水中制備成濃度為3.25mg/ml的混懸液，然后置于4℃冰箱冷藏備用。

1.3主要試劑和儀器 大鼠Smad2試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。Hyp試劑盒：南京建成生物工程研究所。紫外分光度計： 購自美國UVP公司。水平電泳儀（GE-100型）： 杭州大和熱磁電子有限公司。電子天平（FA型）：上海臺之衡電子衡器有限公司。高速微型離心機：德國Eppendorf公司。NABILA175型低溫冰箱：日本松下電器公司產品。

1.4分組和模型建立 所有實驗大鼠在湖南省中醫藥研究院動物實驗中心適應性飼養1w，隨機分為六組：假手術組，模型組，卡托普利組，參竹心康湯低、中、高劑量組，每組12只。參照文獻方法[7]，采用腹主動脈縮窄法制作心衰大鼠模型。大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹部手術區備皮、消毒并鋪一次性無菌紗布，從劍突下腹正中切開皮膚，切口長約3cm，分層打開腹腔，在腎動脈分支以上5mm處鈍性游離腹主動脈，將7號注射器針頭平行置于腹主動脈上，用4號手術絲線將腹主動脈和注射器一同結扎，然后緩慢將注射器撤出，關腹，分層縫合，使大鼠腹主動脈直徑縮窄為0.7mm。假手術組開腹后將手術絲線穿過腹主動脈，除不縮窄腹主動脈外，其他操作與模型組完全相同。術后常規喂養6w后，開始出現明顯心力衰竭癥狀，如呼吸頻率和幅度增加，活動明顯減少，飲食減少，毛發干枯無光澤，爪背紫紺，尿少水腫等。造模后大鼠各組分別死亡1、3、2、3、3、3只。于造模成功后，各組大鼠開始灌胃給藥，其中假手術組、模型組以蒸餾水10mL/kg灌胃，卡托普利組予卡托普利混懸液7.8mg/kg，參竹心康湯低劑量組、中劑量組、高劑量組分別以參竹心康湯中藥煎液11g/kg、22g/kg、44g/kg。以上各藥物組再用蒸餾水稀釋成等體積10mL/kg灌胃，1次/d，連續給藥8w。

1.5心肌組織Smad2測定 實驗結束時，于最后一次給藥后禁食12h，用3%戊巴比妥鈉（45mg/kg）行腹腔注射，大鼠麻醉滿意后仰臥固定于手術臺，切取左室長軸中點水平約5mm厚的心肌組織，嚴格按試劑盒說明書進行檢測，PBS液清洗，組織剪碎，加入PBS液，制成組織勻漿，置于-20℃冰箱過夜。檢測前經2次反復凍融以破壞細胞膜，離心，取上清檢測，取出酶標包被板，標準品孔中加入標準品，待測孔中先加入大鼠心肌勻漿上清，然后再加樣本稀釋液，空白對照孔不加試劑，溫育30min，洗板，每個孔中加入酶標工作液，空白對照孔不加，溫育30min，洗板，顯色，終止，測定，計算。

1.6心肌組織HYP測定 采用堿水解法檢測各組大鼠心肌組織中羥脯氨酸的含量，嚴格按試劑盒說明書進行檢測，按上述方法取心肌組織，用手術剪剪碎后放入試管中水解，將各試管用流水冷卻，冷卻后加入PH調節液，使PH值在6.0～6.8，向各試管中加入蒸餾水至10ml，然后取4ml稀釋的水解液，在其中加入30mg活性炭，搖晃試管使混和均勻，放入離心機中，以3500轉/min的轉速離心10min，若離心后上清液為澄清無色，則說明離心成功，最后小心吸取上清液1.0ml用來檢測。受檢測玻璃試管置于水浴箱內水浴水解，自然冷卻后，以3500轉/分的轉速離心10min，離心后取上清液，以蒸餾水調零，用分光光度計在550nm處，1cm光徑，測定各試管的吸光度。按以下公式計算HYP含量（μg/mg濕重）：（測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度）×標準管含量5μg/ml×水解液總體積（10ml）/組織濕重（mg）。

1.7統計學方法 采用SPSS16.0統計分析軟件處理數據，數據以（x±s）表示，各組間的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1心肌組織HYP變化 與假手術組比較，模型組、卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組心肌組織HYP含量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01），與模型組比較，卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01），參竹心康湯小劑量組降低幅度低于卡托普利組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯高劑量組（P<0.01），見表1。

2.2心肌組織Smad2變化 模型組、卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組心肌Smad2均較假手術組明顯升高（P<0.01）；卡托普利組、參竹心康湯小劑量組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯大劑量組心肌Smad2均明顯低于模型組（P<0.01），參竹心康湯小劑量組降低幅度低于卡托普利組、參竹心康湯中劑量組、參竹心康湯高劑量組（P<0.05），見表2。

3 討論

慢性心力衰竭是心室充盈或射血功能受損的一組綜合征，其發生、發展與多種細胞因子參與的神經內分泌過度激活密切相關，而心肌纖維化是心力衰竭的主要病理基礎[8]，同時心肌纖維化的進展是促進心衰發展的原因之一[9]，因此，有效預防或逆轉心肌纖維化，是防治慢性心力衰竭的重要途徑。心肌纖維化的概念是在20世紀90年代初確立的，它是指在心肌細胞外基質（ECM）中膠原含量過度增加或者膠原的組成部分發生了改變，從而導致心室順應性下降，影響心臟正常的收縮與舒張功能[10]。正常心臟是由心肌細胞及心肌細胞周圍的心臟間質構成。心臟間質主要包括細胞外基質和脈管系統。ECM圍繞在心肌細胞周圍，其作用是保持心臟結構的完整和功能的正常，它在心肌細胞與心肌細胞的信息溝通中發揮著非常重要作用[11]。MF的主要成因便是心肌細胞外基質中的心肌成纖維細胞主動或被動活化、增殖及其導致的膠原增生和沉積，膠原中以羥脯氨酸的含量最多，故通常以羥脯氨酸作為心肌纖維化檢測指標之一。

MF的發生是一個由多種體液因子共同作用的過程，在眾多調控因子中Smads蛋白發揮著重要作用。目前研究發現有三大類Smads[12]： 第一類為特異型Smads，主要有Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，第二類為共同介質型Smads，目前發現主要是Smad4，最后為抑制型Smads，如Smad6、Smad7。Smads通過參與轉化長因子-β（TGF-β）信號轉導而影響心肌纖維化，而Brooks W等研究發現Smad2是傳導TGF-β的主要信息分子[13]。曲巍等研究發現心肌纖維化模型大鼠Smad2明顯表達，經依普利酮干預后心肌纖維化明顯改善，Smad2表達也明顯降低，推測依普利酮可能通過抑制Smad2表達途徑抗心肌纖維化[14]。

以益氣養陰、活血化瘀為治療原則的參竹心康湯是喻正科主任醫師多年臨床實踐的結晶，以黨參、麥冬、黃芪、五味子、玉竹、丹參、三七等為主要組成，其前期研究已證明參竹心康湯能有效的治療慢性心力衰竭。本研究發現模型組、藥物治療組HYP高于假手術組，證明成功建立慢性心力衰竭心肌纖維化大鼠，卡托普利組和參竹心康湯組HYP水平低于模型組，證明卡托普利和參竹心康湯均有抗慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用，參竹心康湯治療組的Smad2水平明顯低于模型組，由此推測，參竹心康湯可有效的抑制慢性心力衰竭心肌纖維化的發生發展過程，抑制Smad2的表達可能是其抗心肌纖維化的機制之一。

參考文獻：

[1]黃群艷.充血性心力衰竭的中醫藥研究進展[J].中醫臨床研究，2011， 3（12）：121-122.

[2]唐燕萍，盧青，陳新宇.充血性心力衰竭的中醫藥治療進展[J].中醫藥導報，2011，17（11）：74-76.

[3]Hunt SA，Abraham WT，Chin MH，et a1.2009 focused update ineorporated into the ACC/AHA 2005 guidelines for the diagnosis and management of heart failure in adults：a report of the American college of cardiology foundation/american heart association task force on practice guidelines[J].J Am Coll Cardiol，2009，53：90.

[4]戴閨柱，顧復生.慢性收縮性心力衰竭治療建議[J].中華心血管病雜志，2002，30（1）：7-10.

[5]張運，徐瑞.MF-心力衰竭治療的新靶標[J].中華醫學雜志，2006，86（17）：1155-1157.

[6]喻正科，李碩，朱筱婧，等.參竹心康湯對CHF患者生活質量影響的臨床研究[J].湖南中醫雜志，2013，29（9）：9-12.

[7]胡詠梅，李法琦，羅羽慧，等.腹主動脈縮窄大鼠模型制作及臨床意義[J].重慶醫科大學學報，2004，29（3）：322-324.

[8]Shahbaz AU，Sun Y，Bhattacharya SK，et al.Fibrosis in hypertensive heart disease： molecular pathways and cardio protective strategies[J].JHypertens，2010，28（S1）：S25-32.

[9]Weber KT，Sun Y，Bhattacharya SK，et al.Myofibroblast-mediated mechanisms of pathological remodelling of the heart[J].Nat Rev Cardiol，2013，10（1）：15-26.

[10]陳蓉，謝梅林.TGF-β/Smads 信號通路在MF發生和治療中應用前景的研究進展[J].中國藥理學通報，2012，28（9）.

[11]Tayebiee MH，MacFadyen RJ，Lip GYH. Extracellular matrix biology：a new frontier in linking the pathology and therapy of hypertension[J].Hypertension，2003，21（6）：2 211-218.

[12]Zhang L，Wang LF，Zhang RY，et al.Effect of Smad7 expression on cardiac fibrosis in postin farcted rats[J].Chin Heart J，2008，20（5）：552-555.

[13]Brooks W，Conrad C.Myocardial fibrosis in transforming growth factor beta1 heterozygous mice[J].J Mol Cell Cardiaol，2000，32（2）：187-195.

[14]曲巍，于波.依普利酮對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的影響及其機制探討[J].山東醫藥，2015，55（4）：26-27.編輯/成森