擬南芥KCS12基因的克隆及其對長鏈脂肪酸代謝調控功能的初步分析

靳遠航 余春娥 鄭育聲

摘 要 本課題從擬南芥中克隆了超長鏈脂肪酸代謝相關的功能基因AtKCS12，轉入酵母（INVSC1）表達系統中表達，檢測酵母細胞中脂肪酸組成。脂肪酸組成結果分析表明，AtKCS12使酵母中棕櫚酸（16∶0）和硬脂酸（18∶0）的相對含量顯著增加了，十八烯酸（18∶1）的相對含量顯著減少了。這些結果共同提示，AtKCS12表達的蛋白不能利用酵母中的脂肪酸作為催化底物合成超長鏈脂肪酸，或者AtKCS12蛋白無酶活性。

關鍵詞 擬南芥；β-酮脂酰輔酶A合成酶；超長鏈脂肪酸；表達載體

中圖分類號：S565.4 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.109

超長鏈脂肪酸（VLCFA）是生物體中碳原子數超過18碳的脂肪酸，直接參與油料作物中甘油脂、生物膜膜脂和鞘脂的生物合成，同時也為角質層蠟質的生物合成提供前體物質[1]。在超長鏈脂肪酸合成過程中，KCS酶是催化第一步縮合反應的調控延伸反應的限速酶[2]。它以酰基-CoA（≥C18）和丙二酰-CoA為原料，合成碳鏈延伸了2個C的β-酮脂酰-CoA[3]。研究顯示，擬南芥KCS基因家族有21個成員，依據氨基酸序列的同源性可將21個成員劃分為FAE1、KCS1、FDH、CER6四個亞組[3]；而依據基因組構成、親緣關系、蛋白質的拓撲結構和3D構象，21個基因成員又可分為8個亞類[4]。這些KCS基因在植物體的不同組織、器官特異性表達，并具有底物特異性。

雖然KCS家族在植物形成長鏈脂肪酸中發揮重要功能已有報道，部分家族成員的具體作用機制也已被證實，但其成員AtKCS12在不同種類脂肪酸形成過程的功能卻鮮有報道。本研究利用分子遺傳的方法，對在擬南芥中編碼脂肪酸代謝途徑中關鍵酶的基因AtKCS12的功能進行研究，為下一步克隆油料作物中的AtKCS12，改善油料作物的含油量，提供更多長鏈以及超長鏈脂肪酸打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥（Arabidopsis）的種子采自本實驗室。TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；INVSc1酵母本實驗室保存；轉化入pYES2的E·Coli本實驗室保存。其他相關試劑購自上海生物工程公司。

1.2 擬南芥RNA提取及cDNA合成

擬南芥葉片的RNA采用CTAB-LiCl法提取[5]。cDNA合成參見TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN，China）。

1.3 酵母表達載體的構建

分別用SacI和XbaI，SacI和EcoRI兩種酶對KCS-pEASY質粒和pYES2質粒進行酶切，T4連接酶連接，重組質粒的轉化。

1.4 重組質粒轉入INVSc1酵母細胞

INVSc1酵母在缺His、Leu、Try、Ura的缺陷培養基上不能生長。pYES2質粒可合成尿嘧啶，故用尿嘧啶缺陷篩選。挑單個菌落接種于20 mL YPD液體培養基中，將1μg質粒DNA，10μL變性鮭魚精子DNA（10 mg/mL）于上述酵母溶液混勻；加入1×LiAc/40%PEG-4000/1×TE，混勻；加入88 μLDMSO混勻，42 ℃加熱7 min；

12 000 rpm離心10 s，重懸細胞，12 000 rpm再離心；涂布于SC-U固體培養基。

1.5 酵母脂肪酸的分析

收集酵母菌體后進行酵母脂肪酸的提取與甲酯化[6]。石英毛細管柱HP-5（30 m×0.35 mm，0.25 μm），程序升溫：從180 ℃開始，以5 ℃/min升到230 ℃，保持20 min；載氣為He，柱流量1.5 mL/min，進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度為FID為230 ℃，分流比30∶1。色譜柱信息：Agilent Technologies，Inc。貨號：125-3237。型號：

DB-FFAP 30 m×0.530 mm，0.5Micro[7]。

1.6 數據處理

采用SAS 6.0統計軟件分析，比較轉基因酵母與對照組酵母中脂肪酸含量的差異。若概率P<0.05，則認為結果是顯著的；若P<0.01，則認為結果是極顯著。

2 結果與分析

2.1 AtKCS12的克隆和序列分析

克隆AtKCS12 cDNA序列片段（見圖1A），將其連接到pEASY 載體后雙酶切（SacI和EcoRI）驗證。結果如圖1B所示，雙酶切（SacI，XbaI）和（SacI，EcoRI）后兩條帶的大小分別為1 500 bp左右與5 900 bp左右，結果與目的基因預期分子量大小相符合。

AtKCS12含有一個1431bp的開放閱讀框架（ORF），編碼一個含476個氨基酸的多肽。AtKCS12基因編碼的氨基酸多肽，是縮合酶超家族的一員，包含查爾酮合酶（CHS_like）高度同源區域，該區域為91-1266bp編碼的392個氨基酸序列，結果表明，該cDNA序列很可能編碼脂肪酸代謝途徑中3-ketoacyl-CoA synthase。

2.2 酵母轉化子鑒定

將目的基因-pYES2重組表達載體轉入INVSc1酵母中，轉化效果良好，隨機挑選4個單菌落將其進行擴培，提取質粒并進行PCR驗證是否成功將表達質粒轉入酵母，結果見圖2。

由圖2可以看出，含目的基因的pYES2重組表達質粒成功轉入酵母中，接下來將通過誘導培養基誘導目的基因表達，收集菌體，進行脂肪酸的提取與檢測分析。

2.3 AtKCS12功能分析

利用氣相-質譜聯用技術（GC-MS）分析酵母主要脂肪酸種類以及總脂肪酸含量。分別培養、誘導酵母轉化子和對照酵母，收集菌體，提取油脂，經甲酯化后進行氣相質譜分析，主要有4個脂肪酸甲酯的峰，分別為C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1。將所得的數據用SAS軟件分析，比較轉基因酵母與對照組酵母脂肪酸含量的差異。分析結果如表1，數據以平均值標準方差的形式表示，而*表示樣品與對照組之間的差異顯著，**表示樣品與對照組之間的差異極顯著。

AtKCS12轉基因酵母和對照的脂肪酸組成分析結果如圖3所示。可以看出，與對照組相比，AtKCS12在轉基因酵母中表達使得酵母中的棕櫚酸（16∶0），硬脂酸（18∶0）的相對含量增加了4.5%，22.78%，十八烯酸（18∶1）的相對含量減少了5.85%，棕櫚烯酸（16∶1）的含量變化不顯著。

3 討論

本實驗克隆了擬南芥cDNA文庫中的AtKCS12基因，并在酵母（INVSc1）中進行表達。分析脂肪酸組成發現，轉基因酵母和空白對照中只有C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1這4種長鏈脂肪酸，與空白對照相比，轉AtKCS12基因的酵母沒有檢測到超長鏈脂肪酸的合成。推測AtKCS12蛋白不能利用酵母中的C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1脂肪酸作為催化底物合成超長鏈脂肪酸，或者在酵母中異源表達的AtKCS12蛋白沒有酶活性。

參考文獻

[1]鄭德松.油脂合成過程中甘油三磷酸脫氫酶基因及乙酰輔酶A羧化酶基因的克隆與鑒定[D].濟南：山東農業大學，2012.

[2]周丹，趙江哲，柏楊，等.植物油脂合成代謝及調控的研究進展[J]. 南京農業大學學報，2012，35（5）：77-86.

[3] Wu G， Wu Y， Xiao L， et al. Zero Erucic Acid trait of Rapeseed （Brassica napus L.） Results from a Deletion of Four Base Pairs in the Fatty Acid Elongase 1 Gene[J].Theoretical and Applied Genetics，2008， 16（4）：491-499.

[4] Costaglioli P， Joubès J， Garcia C， et al. Profiling Candidate Genes Involved in Wax Biosynthesis in Arabidopsis Thaliana by Microarray Analysis[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids， 2005， 1734（3）： 247-258.

[5] Joubès J， Raffaele S， Bourdenx B， et al. The VLCFA Elongase Gene Family in Arabidopsis Thaliana： Phylogenetic Analysis， 3D Modelling and Expression Profiling[J]. Plant molecular biology， 2008， 67（5）： 547-566.

[6]Paul S， Gable K， Beaudoin F， et al. Members of the Arabidopsis FAE1-like 3-ketoacyl-CoA Synthase Gene Family Substitute for the Elop Proteins of Saccharomyces Cerevisiae[J]. Journal of Biological Chemistry， 2006， 281（14）： 9018-9029.

[7]Chi X，Yang Q，Pan L， et al. Isolation and Characterization of Fatty Acid Desaturase Genes from Peanut （Arachis hypogaea L.）[J].Plant Cell Reperts，2011（30）：1393-1404.

（責任編輯：劉昀）