“分解纖維素的微生物的分離”中相關問題探討

徐海麗

【摘 要】結合高中生物選修教學實踐，主要探討了透明圈中心出現紅色的的原因、兩種剛果紅染色法的優缺點比較以及選擇培養基和鑒別培養基的具體作用。

【關鍵詞】選修；剛果紅染色法；透明圈；鑒別培養基

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中生物選修一《生物技術實踐》中專題2“微生物的培養與應用”的一個課題。學習本節內容之前，學生已經掌握了有關微生物的分離和培養的相關知識，通過對“分解纖維素的微生物的分離”的學習和實踐探究，不僅能夠進一步鞏固理論知識，更能激發學生的學習興趣、提高學生的生物科學素養。下面筆者對教學過程中一些困惑進行了初步探討。

一、剛果紅染色法

（1）透明圈中心為什么有紅色的菌落

剛果紅（CR）是一種染料，剛果紅本身是棕紅色粉末。溶于水呈黃紅色；溶于醇呈橙色；極微溶于丙酮；澄清亮紅色溶液。它可以和像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。當含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅就能夠與纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素分解酶分解后，剛果紅—纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。

纖維素屬于天然高分子化合物，在自然界中分布最廣，也是最重要的多糖。它們在無機酸存在下能完全水解，并得到D—葡萄糖。如果纖維素不完全水解，還會得到其他的多聚糖，這些多聚糖就會結合剛果紅形成多元糖—剛果紅紅色復合物。菌絲吸收多聚糖—剛果紅復合物，在菌體內將此復合物分解為可以利用的小分子物質，但是剛果紅不能被利用就沉淀在細胞里面，因此顯示紅色。或者進入菌絲的剛果紅與微生物體內的葡聚糖成分再次結合，形成多聚糖—剛果紅復合物，使剛果紅固定在細胞內，從而使菌落成紅色。在透明圈中央出現紅色菌落，是剛果紅進入菌體的原因。

（2）兩種剛果紅染色法比較

方法一：先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應。

方法二：在倒平板使就加入剛果紅。

細菌生長過程中如果初始沒有色素，則細菌不會大量合成能夠分解色素的物質，在方法一中，后加入的色素來不及被有關酶分解。而方法二，初始有色素，所以更容易出現顏色消退的現象，某些微生物能夠緩慢的降解色素從而導致透明圈。這一過程需要一段時間的培養。

剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應用已經有超過20年的歷史，具體哪種方法更適合，可以根據實際進行選擇。

二、實驗過程中的選擇培養基和鑒別培養基

（1）選擇培養基的作用是什么

在本實驗中，兩次使用了不同的培養基。先來看一下選擇培養基配方：酵母膏中富含微生物生長所需要的必須氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等，但是含量少，不足以作為碳源，所以該培養基還是以纖維素粉作為唯一的碳源，只有纖維素分解菌可以很好的生長，所以可以初步篩選出能夠利用纖維素的微生物，且培養基沒有加入瓊脂，液體培養基可以增加纖維素分解菌的濃度， 以確保能夠從樣品中分離所需的微生物。此過程也稱為富集培養。

（2）鑒別培養基中為什么加土豆汁

首先我們要知道：①微生物通過稀釋涂布平板法要在培養基上繁殖成一個菌落才能夠進行鑒定；②不同微生物基因組成不同，所含的酶系統也不一樣，它們對碳源利用是有選擇的而且有一定的順序，一般淀粉最先被利用，待淀粉消耗完了才會利用纖維素。

土豆汁是一種天然的培養基，不僅含有淀粉，還有很多礦物質和多種維生素，營養豐富，有利于微生物的繁殖。微生物可以利用淀粉作為碳源，但是會使能夠產生淀粉酶的微生物出現假陽性反應，出現比較模糊的透明圈。在鑒別培養之前，由于梯度稀釋和涂布使得菌體的密度下降，在鑒別培養基中加入土豆汁可以讓單個菌體發展到一定數量形成菌落。當然其他的一些分解淀粉的微生物也可以繁殖，但是由于土豆汁的含量太少，其他雜菌還沒有形成菌落之前淀粉被消耗完了，不能形成菌落，只剩纖維素作為碳源了，最后只有纖維素分解菌能夠繼續利用纖維素繁殖成菌落。所以鑒別培養基加土豆汁是為了讓纖維素分解菌更好的繁殖，以便形成菌落。

結合相關實驗表明，該CMC-Na鑒別培養基也可以用秸稈纖維素粉培養基和濾紙片鑒別培養基代替，這兩種培養基中纖維素含量高，且制作簡單，同時產生的透明圈也清晰，篩選出的纖維素分解菌應用價值更高。